Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup> 2 +</sup> Geçici ve Membran Akımlar
Summary
Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu anlatır<sup> 2 +</supElektrofizyolojik patch-clamp çalışmaları ile birlikte> ölçümleri.
Abstract
Yama klemp tekniği ve kalp hücresel Ca 2 arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özelliklerinin çalışma + taşıma anomaliler izole kardiyomiyositlerin gerektirir. Buna ek olarak, bu yöntemler kullanılarak hastaların miyositleri araştırmak için olasılık, bu tür atriyal fibrilasyon (AF) ve kalp hastalıklarının moleküler temeli aydınlatmak için çok değerli bir gerekliliktir. 1 Burada her iki için uygun olan insan atrial miyositlerinde bölgesinin izolasyonu için bir yöntem tarif Patch-clamp çalışmaları ve hücre içi Ca2 + konsantrasyonu aynı anda ölçümleri. İlk olarak, açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları küçük doku parçaları ("yığın yöntemi") içine doğranmış ve +-ücretsiz bir çözüm Ca 2 yıkanır. Daha sonra doku parçaları 20 mcM Ca 2 + ile çözümler içeren kollajenaz ve proteaz sindirilir. Bundan sonra, izole edilmiş olan miyosit Harvedoku süspansiyonu filtrasyon ve santrifüj ile sted. Son olarak, hücre depolama çözelti içinde Ca2 + konsantrasyonu 0.2 mM kademeli bir şekilde ayarlanır. Biz kısaca + ve Ca 2 + izolasyon işlemi sırasında tampon ve aksiyon potansiyelleri ve membran akımlarının temsilcisi kayıtları sağlamak, her ikisi birlikte aynı anda Ca 2 + geçici ölçümler, bu izole miyositler yapılan ile Ca 2 anlamını tartışmak.
Introduction
Yama klemp tekniği ve + taşıma anormallikleri izole kardiyomiyositlerin gerektiren hücresel Ca 2 arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özellikleri incelenmesi. Bunlar genellikle sindirim enzimleri kardiyak doku örneklerinin in vitro maruz kalma (kolajenaz, hiyaluronidaz, peptidaz vb) ardından elde edilir. 1.955 2'de canlı kalp miyositlerin izolasyonu ilk rapordan bu yana protokoller büyük miktarda fare, sıçan, tavşan, köpek, kobay ve insan dahil olmak üzere farklı türlerden tek atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde hasat için geliştirilmiştir. Bu derlemede insan atriyal miyositlerin izolasyonu odaklanın. Biz Worthington Biyokimyasal Corp, ABD (tarafından sağlanan "Worthington Doku Ayrılma kılavuzu" bölümüne bakın diğer türlerden miyositlerin izolasyonu için prosedürleri ile ilgili www.tissuedissociation.com ).
<p class= "Jove_content"> İnsan atriyal miyosit izolasyon protokolleri genellikle Burada amacıyla önceden yayınlanmış bir yöntem uyarlanan bir teknik bir adım-adım bir açıklaması, sağlamak Bustamante, ve diğ. 3 açıklanan yöntem kullanılarak elde edilmiştir Patch-clamp deneyler için değil, aynı zamanda eş zamanlı olarak hücre içi Ca2 + ölçümü için sadece uygun atrial miyositlerinde elde edilir. 4-11Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları insan atriyal miyositlerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Sitosolik Ca2 ölçümleri için bu miyositler kullanmak için + Eğer saklama çözeltisinden EGTA ihmal edilmesi ile daha önce tarif edilen yöntem 4-11 uyarlanmıştır.
Zaten 1970 yılında bu miyositler + sindirim sırasında Ca 2 varlığında ayırmak rağmen, hepsi nedenle kontraktürü ve cansız. 16,17 içinde olduğu gözlenmiştir, hücre izolasyonu Ca 2 +-ücretsiz bir çözüm yapılır. Ancak, Ca 2 fizyolojik konsantrasyonlarının yeniden giriş + hızlı Ca 2 + akını ve hücre ölümüne neden oldu. Bu aslında Zimmerman ve Hulsman ile perfüze gözlenmiştir Ca2 + paradoks bir olgu olarak tarif edilmiştir. 7.0 pH azaltılması da dahil olmak üzere yalıtım ortamı 18 Değişiklikler <taurin 20 veya Ca 2 + (adım 3.2 ve 4.1 'e bakınız), 21 yanı sıra, depolama çözelti 22 EGTA ihtiva eden izole miyosit depolama küçük miktarlarda> 19, ek destek Ca2 + paradoksu. 17 engellemek için öne sürülmüştür Bununla birlikte, iyi bir Ca2 + EGTA ile tampon L-tipi Ca 2 + akımı genliği ile indüklenen Ca2 + geçici genlik ve Ca2 + geçici bifazik bir çürüme ile sonuçlanır azalttığı bilinmektedir. 23. Bu nedenle, EGTA ihmal Tipik özellikleri ve tek fazlı bozunur olan Ca2 + geçici elde etmek için, tüm süreç boyunca izolasyon. Ca 2 + hücreleri korumak için paradoks biz 0.2 mM kadar kademeli bir şekilde depolama çözeltinin nihai Ca2 + konsantrasyonu artar.
Kollajenaz seçimi muhtemelen başarılı miyosit izolasyon için en önemli adımdır. Geleneksel collagenases Clostridium histolyticum elde edilen ham preparatlar olup diğer proteinazlar polysaccharidases ve lipazlar arasında bir dizi ek kolajenaz içerir. Kendi genel kompozisyon kolajenazlar göre farklı bölünmüştür. 24 Worthington kollajenaz Türleri I ve II başarıyla anda açıklanan protokolde insan atriyal miyositlerin izolasyonu. 4-10,15,25-30 için kullanılmıştır biz kollajenaz kullanılmasını tavsiye biz de kollajenaz Tip II kullanarak canlı hücreler kabul edilebilir miktarda elde etmek mümkün olmasına rağmen, ben yazın. Ancak, hatta tek bir kollajenaz tip içinde enzim faaliyetleri ile ilgili önemli bir toplu-seri farklılıklar vardır. Bu varyasyonlar dikkatli toplu seçimi ve izolasyon prosedürü optimize etmek için çeşitli gruplar test gerektirir. Worthington Biyokimyasal Corp (den online olarak mevcuttur toplu-seçim aracı http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php), insan atrial miyosit izolasyonu için uygun olduğu gösterilmiştir bir bileşim ile uygun gruplar bulmak için de kullanılabilir. Şu anda kollajenaz 250 U / mg kollajenaz aktivite, 345 U / mg caseinase aktivite, 2.16 U / mg clostripain aktivite ve 0.48 U / mg triptik aktivite (lot # 49H11338) ile tip I kullanın.
Bu makalede tarif edilen prosedür kullanılarak elde edilen hücreler patch-clamp çalışmaları, Ca2 + geçici ölçümleri ve ek olarak her iki. 15 bir kombinasyonu için 8 saat içinde kullanılabilir, bu hücrelerin elektrik alanı uyarılmasına tepki olarak hücre daralma ölçümü sağlar ya da elektrik stimülasyonu yama-kelepçe pipet (yayınlanmamış gözlemler) kullanarak.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Buna ek olarak, onların mükemmel teknik destek için insan atriyal doku ve Claudia Liebetrau, Katrin Kupser ve Ramona Nagel sağlanması için Heidelberg Üniversitesi'nde kalp cerrahlar teşekkür ederim. Onun yararlı öneriler ve Ca 2 + geçici ölçümlerin kuruluş aşamasında danışmanlık için de Andy W. Trafford için teşekkür etmek istiyorum. Onlar hücresel elektrofizyoloji ve kardiyomiyosit izolasyon temel teknikleri ve becerileri öğrenmek için bize sunulan fırsatı için Teknoloji Dresden Üniversitesi: Yazarlar Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı (Ursula Ravens kafa) üyelerine en derin şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz.
Yazarlar araştırma Alman Araştırma Vakfı (Do769/1-1-3), Atriyal fibrilasyon Yetkinlik Ağı aracılığıyla Eğitim ve Araştırma Alman Federal Bakanlığı (01Gi0204) ve Kardiyovasküler Araştırma için Alman Merkezi aracılığıyla Avrupa Birliği tarafından desteklenmektedir EuAtriyal fibrilasyon içinde Translational Araştırma Sanatlar Lisesi, Avrupa Ağı (EUTRAF, FP7-SAĞLIK-2010, büyük ölçekli entegre proje, Teklif No 261057) ve Avrupa-Kuzey Amerika Atriyal fibrilasyon Araştırma Birliği (ENAFRA) Vakfı Leducq (07CVD03) bir hibe.
Video dosyası gösterilen şematik bir genel Servier, tıp tekniğinde kullanılarak üretildi.
Materials
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| Company | Catalogue number | Bath solution | |
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| Company | Catalogue number | Pipette solution | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
Riferimenti
- Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
- Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
- Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
- Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
- Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
- Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
- Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
- Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
- Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
- Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
- Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
- Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
- Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a “KB medium”. Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
- Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
- Worthington, K., Worthington, V. . Worthington Enzyme Manual. , (1993).
- Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
- Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
- Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
- Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
- Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
- Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).
