JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup> 2 +</sup> Transients en Membraan Currents

Published: July 03, 2013
doi:
10.3791/50235
, ,
1Institute of Pharmacology,University of Duisburg-Essen , 2Division of Experimental Cardiology,University of Heidelberg

Summary

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire Ca<sup> 2 +</sup> Metingen in combinatie met elektrofysiologische patch-clamp studies.

Abstract

De studie van de elektrofysiologische eigenschappen van de cardiale ionenkanalen met de patch-clamp techniek en de verkenning van cardiale cellulaire Ca 2 + behandeling van afwijkingen vereist geïsoleerde hartspiercellen. Bovendien is de mogelijkheid om myocyten onderzoeken van patiënten met behulp van deze technieken is een waardevol vereiste om de moleculaire basis van hartaandoeningen zoals atriale fibrillatie (AF) te helderen. 1 Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van menselijke atriale myocyten die geschikt zijn voor beide patch-clamp studies en gelijktijdige meting van intracellulaire Ca2 + concentraties. Eerst worden rechts hartoren verkregen van patiënten die een openhartoperatie gesneden in kleine stukjes weefsel ("chunk method") en in Ca2 +-vrije oplossing gewassen. Dan het weefsel brokken verteerd in collagenase en protease bevattende oplossingen met 20 uM Ca2 +. Daarna, de geïsoleerde myocyten zijn harvested door filtratie en centrifugering van de weefselsuspensie. Tenslotte wordt de Ca2 +-concentratie in de cel opslagoplossing stapsgewijs aangepast tot 0,2 mM. We kort de betekenis van Ca 2 + te bespreken en Ca 2 + buffering tijdens de isolatie proces en bieden ook representatief opnames van actiepotentialen en membraan stromen, zowel samen met gelijktijdige Ca 2 + voorbijgaande metingen, uitgevoerd in deze geïsoleerde myocyten.

Introduction

Studeren elektrofysiologische eigenschappen van de cardiale ionenkanalen met de patch-clamp techniek en de verkenning van cellulaire Ca 2 + handling afwijkingen vereisen geïsoleerde hartspiercellen. Deze worden gewoonlijk verkregen bij de in vitro blootstelling van hartweefsel monsters spijsverteringsenzymen (collagenase, hyaluronidase, peptidase etc.). Aangezien het eerste rapport van isolatie van levensvatbare hartspiercellen in 1955 2 een grote hoeveelheid protocollen ontwikkeld om enkele atriale en ventriculaire hartspiercellen oogsten van verschillende species, waaronder muis, rat, konijn, hond, cavia en mens. In deze review richten we ons op de isolatie van humane atriale myocyten. Betrekking tot de procedures voor de isolatie van myocyten van andere soorten wordt verwezen naar het "Worthington Tissue Dissociation guide" die door Worthington Biochemical Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).

<p class= "Jove_content"> Human atriale myocyten isolatieprocedures zijn algemeen afgeleid van de door Bustamante, et al.. 3 Hier geven we een stap voor stap beschrijving van een techniek, die is aangepast van een eerder gepubliceerde methode, teneinde werkwijze vinden atriale myocyten niet alleen geschikt voor patch-clamp experimenten maar ook voor gelijktijdige intracellulaire Ca2 + metingen. 4-11

Protocol

Experimentele protocollen moeten worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie en alle patiënten moeten schriftelijk toestemming geven. Ons onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Faculteit Mannheim, Universiteit van Heidelberg (# 2011-216N-MA) en werd uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming. 0. Verkrijgen Human Atrial Tissue Tijdens routine canulatie procedures bij patiënten die openhartchirurgie voor cardiopulmonale bypass, wordt het uiteinde van de rechter hartoor meestal verwijderd en kan worden gebruikt voor isolatie van atriale cardiomyocyten. Na excisie het weefselmonster onmiddellijk overgebracht in een 50 ml Falcon buis met steriele Ca 2 +-free transport oplossing die 2,3-butaandion monoxime (Tabel I; BDM, contractiele inhibitor, waardoor myocyten contracture). Met transporttijden tussen 30 en 45 minuten, we hebben niet een duidelijk voordeel van het koelen of zuurstof te herkennen met betrekking tot zowel het aantal en de kwaliteit van geïsoleerde atriale hartspiercellen. In het algemeen het vervoer naar het laboratorium moet zo snel mogelijk. Indien langere vervoerstijd niet kan worden vermeden, transport bij 4 ° C in geoxygeneerde oplossing kan voordelig zijn. 1. Prearrangements Schakel de thermocirculator, dat de temperatuur van de mantel voorziene beker (tabel II) regelt. Zorg ervoor dat de temperatuur in de beker is gelijk aan 37 ° C. Dek het bekerglas af met een glazen deksel op een constante temperatuur in de beker te behouden gedurende de gehele isolatie proces. Weeg de Collagenase I en protease XXIV in drie glazen bekers en bewaar deze op kamertemperatuur. De enzymen worden verdund vlak voor gebruik. WINKEL 20 ml Ca2 +-vrije oplossing in een petrischaal bij 4 ° C. WINKEL 250 ml Ca 2 +-vrije oplossing in een waterbad bij 37 ° C. 2. Reinigen van het Weefsel Overdracht samen het weefselmonster met de transport-oplossing in een petrischaal (~ 10 cm diameter) en verwijder vetweefsel ruwweg met een schaar. Weeg het weefselmonster. Tussen 200 en 600 mg worden gebruikt voor celisolatie. Restmateriaal kan worden ingevroren in vloeibare stikstof voor latere biochemische analyse. Breng het weefselmonster in de petrischaal met 20 ml Ca2 +-vrije oplossing bij 4 ° C (zie stap 1.3) en hak het weefselmonster in kleine stukjes van ongeveer 1 mm3 groot. De volgende stappen worden uitgevoerd bij 37 ° C en onder continu begassen met 100% O2. Een pipet tip kan op de zuurstofslang worden geplaatst om sterke borrelen voorkomen en het genereren van continue luchtstroom. Breng de stukken weefsel met de Ca2 +-vrije oplossingvoor het dubbelwandige beker en voorzichtig roeren gedurende 3 min met een magnetische roerstaaf. Stop met roeren en laat het weefsel brokken om neer te strijken voor een paar seconden. De stam van de bovenstaande vloeistof voorzichtig door een nylon (200 micrometer, tabel II). Terug de ingetogen weefsel brokken uit het gaas in de beker met behulp van een tang. Vul het bekerglas met Ca 2 + gratis oplossing en herhaal de wasstap 2.4 en 2.5 twee keer. 3. Eerste enzymatische spijsvertering Resuspendeer de weefsel brokken met 20 ml Enzymoplossing E1 (Tabel I) die collagenase en protease en zorgvuldig roer gedurende 10 minuten. Voeg 40 ul van 10 mM CaCl2-oplossing tot een eindconcentratie van 20 uM Ca2 + te verkrijgen. Na 35 min zeef het supernatant voorzichtig door een nylon mesh (200 urn, tabel II) op een manier dat de meeste stukjes weefsel blijven in het bekerglas. Terug rustregende weefsel brokken uit het gaas in de beker. 4. Tweede enzymatische spijsvertering Resuspendeer het weefsel brokken opnieuw met 20 ml enzymoplossing E2 met alleen I collagenase (Tabel I). Voeg 40 ul van 10 mM CaCl2-oplossing direct tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM Ca2 + te verkrijgen. Tijdens het tweede spijsvertering gebruik schaar om verder te hakken weefsel stolsels af. Na 5 min nemen een monster met behulp van een Pasteur pipet om de dissociatie van de cellen te controleren. Herhaal dit elke 2-3 min tot staafvormige, gegroefde hartspiercellen verschijnen. Stop met roeren en laat het weefsel brokken om neer te strijken voor ongeveer 20-30 sec. Zeef de bovenstaande vloeistof voorzichtig door een nylon (200 micrometer, tabel II) in een 50 ml Falcon buis (buis A). Terug de ingetogen weefsel brokken uit het gaas in de beker. Resuspendeer de weefsel brokken in het bekerglas met 20 ml storage oplossing (Tabel I) 10 en verder distantiëren van de cellen door zachte mechanische trituratie met behulp van een 20 ml serologische pipet met dispenser. Probeer te blaasvorming te vermijden, omdat bubbels zijn nadelig voor overleving van de cel en de kwaliteit. Zeef de bovenstaande vloeistof voorzichtig door een nylon (200 micrometer, tabel II) in een 50 ml Falcon buis (buis B). 5. Final Voorbereiding en aanpassing van Final Ca 2 + Concentratie Centrifugeer beide Falcon buizen A en B (zie stap 4,5 en 4,7) bij 95 g gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit beide tubes voorzichtig door aspiratie. Zorg ervoor dat de pellet niet te verstoren. Verwijder het supernatant. Resuspendeer zowel pellets in 1,5 ml storage-oplossing (Tabel I) elk (kamertemperatuur). Voeg twee keer 7,5 ul van 10 mM CaCl2-oplossing in elk Falcon en roer voorzichtig. Incubeer gedurende 10 minuten na elke stap. Voeg 15 ul van 10 mM CaCl2-oplossing tot een uiteindelijke Ca2 + concentratie van 0,2 mM te verkrijgen. 6. Laden van Myocyten met de TL-Ca 2 +-indicator Fluo-3 AM (figuur 1) Breng 1,5 ml celsuspensie (buis A en / of buis B) in een 2 ml microcentrifugebuis (Eppendorf buis). De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met inachtneming van de lichtgevoeligheid van de fluorescerende Ca 2 +-indicator Fluo-3. Los 50 pg van het membraan permeabele acetoxymethylester derivaat van Fluo-3 (Fluo-3 AM Tabel III) in 44 pl van het Pluronic F-127 (Tabel III) stock oplossing (20% w / v in watervrij DMSO) om een 1 mM Fluo-3:00 voorraadoplossing, die bij -20 ° C gedurende maximaal 1 week kan worden opgeslagen. Voeg 15 ul van de Fluo-03:00 stockoplossing aan de microcentrifugebuis met 1,5 ml celsuspensie (zie stap 6.1) en schudzorgvuldig. Incubeer de celsuspensie gedurende 10 min in een optisch ondoorzichtige doos. Kort centrifugeren bij ongeveer 6000 rpm. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 ml bad-oplossing (tabel IV). Laat de celsuspensie gedurende ongeveer 30 min voor ontestering alvorens te beginnen met experimenten. 7. Gelijktijdige Patch-clamp en epifluorescerende Ca 2 + Metingen Sinds patch-clamp metingen zijn niet het belangrijkste onderwerp van deze beoordeling, verwijzen we de geïnteresseerde lezer naar andere publicaties met een meer diepgaande beschrijving van deze techniek. 11-14 Voor de volledigheid hebben we een korte samenvatting van een protocol voor het meten actiepotentialen of L-type Ca2 + stromen, zowel samen met gelijktijdige Ca 2 +-voorbijgaande opnamen. Tijdens experimenten myocytes worden superfused bij 37 ° C met bad solutiop (Tabel IV) met behulp van een snelle perfusie-systeem (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Voor voltage-clamp experimenten worden K + stromen geblokkeerd door toevoeging van 4-aminopyridine (5 mmol / L) en BaCl2 (0,1 mmol / L) aan de badoplossing. Borosilicaatglas micro-elektroden worden gebruikt en moeten tip weerstanden van 2-5 MQ wanneer gevuld met pipet oplossing (tabel V). Naast de Fluo-3:00 laden van de myocyten (zie stap 6) wordt Fluo-3 ook in de pipet-oplossing (Tabel V). Fluorescentie is enthousiast bij 488 nm en uitgezonden licht (<520 nm) omgezet in [Ca 2 +] i in de veronderstelling waarbij k d = dissociatie constante van Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescentie;. F max = Ca 2 +-verzadigde fluorescentie verkregen aan het einde van elk experiment 12 Zowel elektrische signalen en epifluorescerende Ca2 + signalen simultaan opgenomen. Actiepotentialen worden gestimuleerd bij 0,5 Hz in de huidige-clamp-modus met 1 msec stroom pulsen van 1,2 x drempel kracht. L-type Ca2 +-stromen worden gemeten voltage-clamp modus met een holding potentiaal van -80 mV en 100 msec ramp-puls naar -40 mV aan de snelle Na +-stroom, gevolgd door inactiveren 100 msec proef-puls naar 10 mV bij 0,5 Hz.

Representative Results

Figuur 2A toont drie representatieve voorbeelden uit geïsoleerde mensenrecht atriale myocyten. Te kwantificeren de cel opbrengst pipet we 10 ul van celsuspensie (stap 5.5) op een CellFinder microscoopdia ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Gemiddelde cel opbrengsten in figuur 2B tonen duidelijk aan dat er een tendens tot lagere opbrengsten in cel chronische AF (CAF) patiënten monsters (A, lengte: 16,5 ± 3,1 cellen/10 gl (n = 29) versus 5,1 ± 2,3 cellen/10 gl (n = 10) in SR en caf respectievelijk, p <0,05; buis B: 17,9 ± 3,9 cellen/10 gl (n = 29) versus 5,9 ± 2,0 cellen/10 gl (n = 9) in SR en caf, respectievelijk p = 0.107). Representatieve voorbeelden van de actie-potentiaal metingen en gelijktijdige opnames cytosolisch Ca2 + transiënten zijn aangegeven in figuur 3. In ongeveer 90% van de onderzochte cellen, thij actie-potentiële-geactiveerd Ca2 + vrijstelling veroorzaakt duidelijk en gewone mobiele weeën. Zoals eerder gemeld, de rust membraanpotentiaal, die een aanvaarde indicator voor cellulaire integriteit, gemiddeld ongeveer -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocyten / patiënten) en -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocyten / patiënten ) in respectievelijk SR en CAF (p> 0.05). 15 Figuur 4 toont vertegenwoordiger gelijktijdige opnames van voltage-gated L-type Ca 2 + stromen en cytosolische Ca 2 + transiënten. Toepassing van de niet-selectieve β-adrenoceptor agonist isoprenaline (1 uM) verhoogt amplitudes van zowel Ca I, L en cytosolische Ca2 + transiënten, suggereert intacte β-adrenerge signaaltransductie cascade. Figure 1. Stroomschema van de myocytes Fluo-03:00 laad-protocol (zie stap 6,1-6,5). m / v, massa / volume. Figuur 2. A, geïsoleerde humane rechter atrium myocyten na een uur opslagoplossing. B, gemiddelde ± SEM van de cel opbrengst geteld in 10 pi cellen in bewaarvloeistof (zie stap 5.5). n verwijst naar het aantal preparaten in elke groep. * P <0,05. Figuur 3. Vertegenwoordiger opnames van actie-potentiële-triggered Ca 2 +-transiënten (CAT) in een atriale myocyt van een sinusritme en een chrONIC boezemfibrilleren patiënt. Top: Ingespoten membraan stroom (M) voor stimulatie (0,5 Hz). Hieronder: Gelijktijdig opnemen van membraanpotentiaal (V M), en getriggerd CaT (onderaan). (Opnieuw geplot met toestemming van Voigt et al.. 2012) 15 Figuur 4. Vertegenwoordiger opnames van isoprenaline (1 uM) effect op L-type Ca2 + stroom-triggered Ca 2 +-transiënten (CAT) in een atriale myocyten van een sinus ritme en chronisch boezemfibrilleren patiënt. Top: Voltage-clamp-protocol (0.5 Hz). Hieronder: Gelijktijdig opnemen van de totale netto-membraan stroom (I M), hoofdzakelijk als gevolg van L-type Ca 2 + stroom (midden) en getriggerd CaT (onderaan). (Opnieuw geplot met toestemming van Voigt,et al.. 2012) 15 Tabel I. Solutions. Tabel II. Specifieke apparatuur. Tabel III. Stoffen voor het laden van myocyten met Fluo-03:00. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabel 4" fo:content-width = "2.5in" fo: "> Tabel IV. Bad oplossing voor patch-clamp. Tabel V. Pipette oplossing voor patch-clamp *.

Discussion

Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van menselijke atriale myocyten van rechts hartoren verkregen van patiënten die een openhartoperatie. Om deze myocyten gebruiken voor metingen van cytosolische Ca 2 + pasten wij een eerder beschreven werkwijze 4-11 door niet EGTA de opslagoplossing.

Al in 1970 werd geconstateerd dat hoewel myocyten dissociëren bij aanwezigheid van Ca 2 + tijdens de spijsvertering, ze waren in contractuur en niet-levensvatbaar. 16,17 Daarom wordt celisolatie uitgevoerd in Ca 2 +-free oplossing. De herintroductie van fysiologische concentraties van Ca 2 + resulteerde in een snelle Ca2 + influx en celdood. Dit is beschreven als de Ca2 + paradox verschijnsel dat oorspronkelijk werd waargenomen in geperfundeerde harten door Zimmerman en Hulsman. 18 Modificaties van de isolatiemedia waaronder vermindering van de pH tot 7,0, <sup> 19 toevoeging van taurine 20 of van kleine hoeveelheden Ca 2 + (zie stap 3.2 en 4.1), 21 alsmede opslag van geïsoleerde myocyten in EGTA met storage-oplossing 22 zijn voorgesteld de Ca 2 + paradox. 17 te voorkomen Het is echter bekend dat Ca2 + buffering door EGTA reduceert de amplitude van het L-type Ca2 + stroom-geïnduceerde Ca2 + voorbijgaande amplitudes en resulteert in een bifasisch verval van de Ca2 + transiënten. 23 Daarom hebben we weggelaten EGTA het gehele isolatie proces om Ca2 + transiënten verkrijgen met karakteristieke eigenschappen en monofasische vervalt. Om de cellen tegen de Ca 2 + paradox verhoogden we de uiteindelijke Ca2 + concentratie van de storage oplossing stapsgewijs tot 0,2 mM.

De keuze van collagenase is waarschijnlijk de meest kritische stap voor een succesvolle myocyten isolatie. Conventionele collagenases zijn ruwe bereidingen uit Clostridium histolyticum en bevatten collagenase naast een aantal andere proteasen, polysaccharidases en lipasen. Algemeen genomen samenstelling collagenase worden onderverdeeld in verschillende soorten. Worthington 24 collagenase type I en II met succes gebruikt voor de isolatie van menselijke atriale myocyten. 4-10,15,25-30 In het hier beschreven protocol aanbevolen het gebruik van collagenase Type I, maar we waren ook in staat om aanvaardbare hoeveelheid levensvatbare cellen met behulp van collagenase type II te verkrijgen. Zelfs binnen een collagenase Type er een significante variatie van partij tot partij met betrekking tot de enzymactiviteit. Deze variaties vereisen zorgvuldige batch selectie en het testen van de verschillende partijen om isolatieprocedure optimaliseren. De online beschikbare batch-selectietool van Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) worden gebruikt om beschikbare batches vinden met een samenstelling die geschikt gebleken voor de isolatie van menselijke atriale myocyten zijn. Momenteel gebruiken we collagenase type I met 250 U / mg collagenase activiteit, 345 U / mg caseinase activiteit, 2,16 U / mg clostripain activiteit en 0,48 U / mg tryptic activiteit (lot # 49H11338).

De cellen verkregen volgens de in dit manuscript beschreven procedure kan worden gebruikt binnen 8 hr voor patch-clamp studies, Ca2 + voorbijgaande metingen en een combinatie van beide. 15 Bovendien zijn deze cellen mogelijk metingen van cellulaire contractie in respons op elektrische veld stimulatie of elektrische stimulatie met behulp van de patch-clamp pipet (ongepubliceerde waarnemingen).

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Daarnaast danken wij de hartchirurgen aan de Universiteit van Heidelberg voor de levering van menselijke atriale weefsel en Claudia Liebetrau, Katrin Kupser en Ramona Nagel voor hun uitstekende technische ondersteuning. Speciale dank ook aan Andy W. Trafford voor zijn nuttige suggesties en adviezen tijdens de oprichting van de Ca 2 + voorbijgaande metingen. De auteurs willen hun diepste dank betuigen aan de leden van de afdeling Farmacologie en Toxicologie (hoofd: Ursula Ravens) van de Technische universiteit van Dresden voor de kans die ze bood ons aan basistechnieken en vaardigheden in cellulaire elektrofysiologie en cardiomyocyte isolement te leren.

Onderzoek van de auteurs wordt gesteund door de Duitse Research Foundation (Do769/1-1-3), het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek door het boezemfibrilleren Competence Network (01Gi0204) en het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek, de Europese Unie via de Europese Network for Translational Research in boezemfibrilleren (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, grootschalige integrerende projecten, Voorstel nr. 261057) en het Europees-Noord-Amerikaanse Boezemfibrilleren Research Alliance (ENAFRA) toekenning van Fondation Leducq (07CVD03).

Het schematisch overzicht weergegeven in het videobestand werd geproduceerd met behulp van Servier medische kunst.

Materials

      Transport solution
Albumin Sigma-Aldrich A3059 Storage solution: 1%
BDM Sigma-Aldrich 31550 Transport solution: 30
DL-b-Hydroxy-butyric acid Sigma-Aldrich H6501 Storage solution: 10
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Transport solution: 20
Ca2+-free solution: 20
Enzyme solution E1 and E2: 20
Storage solution: 10
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1251 Storage solution: 70
KCl Merck 1049360250 Transport solution: 10
Ca2+-free solution: 10
Enzyme solution E1 and E2: 10
Storage solution: 20
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 Transport solution: 1.2
Ca2+-free solution: 1.2
Enzyme solution E1 and E2: 1.2
Storage solution: 10
MgSO4 Sigma-Aldrich M9397 Transport solution: 5
Ca2+-free solution: 5
Enzyme solution E1 and E2: 5
MOPS Sigma-Aldrich M1254 Transport solution: 5
Ca2+-free solution: 5
Enzyme solution E1 and E2: 5
NaCl Sigma-Aldrich S3014 Transport solution: 100
Ca2+-free solution: 100
Enzyme solution E1 and E2: 100
Taurin Sigma-Aldrich 86330 Transport solution: 50
Ca2+-free solution: 50
Enzyme solution E1 and E2: 50
Storage solution: 10
Collagenase I Worthington 4196 Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml
Protease XXIV Sigma-Aldrich P8038 Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*
pH     Transport solution: 7.00
Ca2+-free solution: 7.00
Enzyme solution E1 and E2: 7.00
Storage solution: 7.40
adjusted with     Transport solution: 1 M NaOH
Ca2+-free solution: 1 M NaOH
Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH
Storage solution: 1 M KOH
      Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.
      Table I. Solutions.
  Company Catalogue number  
Nylon mesh (200 μm) VWR-Germany 510-9527  
Jacketed reaction beaker VWR KT317000-0050  
      Table II. Specific equipment.
  Company Catalogue number  
Dimethyl-sulphoxide Sigma-Aldrich D2650  
Fluo-3 AM (special packaging) Invitrogen F-1242  
Pluronic F-127 Invitrogen P6867  
      Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.
  Company Catalogue number Bath solution
4-aminopyridine* Sigma-Aldrich A78403 Bath solution: 5
BaCl2* Sigma-Aldrich 342920 Bath solution: 0.1
CaCl2 × 2H2O Sigma-Aldrich C5080 Bath solution: 2
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Bath solution: 10
HEPES Sigma-Aldrich H9136 Bath solution: 10
KCl Merck 1049360250 Bath solution: 4
MgCl × 6H2O Sigma-Aldrich M0250 Bath solution: 1
NaCl Sigma-Aldrich S3014 Bath solution: 140
Probenecid Sigma-Aldrich P8761 Bath solution: 2
pH     Bath solution: 7.35
adjusted with     Bath solution: 1 M HCl
      Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.
  Company Catalogue number Pipette solution
DL-aspartat K+-salt Sigma-Aldrich A2025 Pipette solution: 92
EGTA Sigma-Aldrich E4378 Pipette solution: 0.02
GTP-Tris Sigma-Aldrich G9002 Pipette solution: 0.1
HEPES Sigma-Aldrich H9136 Pipette solution: 10
KCl Merck 1049360250 Pipette solution: 48
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Pipette solution: 1
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383 Pipette solution: 4
Fluo-3** Invitrogen F3715 Pipette solution: 0.1
pH     7.20
adjusted with     1 M KOH
      Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
  2. Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
  3. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
  4. Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
  5. Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
  6. Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
  7. Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
  8. Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
  9. Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
  10. Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
  11. Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
  12. Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
  13. Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
  14. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  15. Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
  16. Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
  17. Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
  18. Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  19. Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
  20. Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
  21. Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
  22. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a “KB medium”. Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
  23. Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
  24. Worthington, K., Worthington, V. . Worthington Enzyme Manual. , (1993).
  25. Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
  26. Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
  27. Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
  28. Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
  29. Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
  30. Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).

Tags

Human Atrial MyocytesPatch-clampCa2+ TransientsMembrane CurrentsAtrial FibrillationCell IsolationCollagenaseProteaseCa2+ Buffering

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Voigt, N., Zhou, X., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents. J. Vis. Exp. (77), e50235, doi:10.3791/50235 (2013).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image