مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية
Summary
هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.
Abstract
وتستند هذه الطريقة الكهربية التي نعرضها على غشاء بدعم الصلبة (SSM) تتألف من طبقة octadecanethiol chemisorbed على الذهب المطلي رقاقة الاستشعار وأحادي الطبقة فسفاتيديل على القمة. هي التي شنت هذه الجمعية في نظام كفيت يحتوي على الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة.
بعد امتصاص شظايا غشاء أو proteoliposomes يحتوي على بروتين غشاء من الفائدة، يتم استخدام تبادل حل سريع للحث على نشاط النقل من البروتين الغشاء. في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، وهناك حاجة واحدة غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط ونظام صمام والأنابيب داخل قفص فاراداي.
يتم الحصول على حركية ونشاط النقل كهربي عبر اقتران بالسعة بين SSM وproteoliposomes أو شظايا غشاء. الأسلوب، وبالتالي، ينتج transien فقطر التيارات. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. التيارات الوقت نقل تعتمد يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر.
يناسب هذا الأسلوب وخاصة بالنسبة للنقل بدائية النواة أو نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، والتي لا يمكن التحقيق من قبل المشبك التصحيح أو أساليب المشبك الجهد.
Introduction
نحن هنا لشرح نهج الكهربية جديدة تقوم على غشاء الصلبة المدعومة (SSM) لتوصيف البروتينات الغشاء كهربي.
يتكون دعم قوي من طبقة رقيقة من الذهب على شريحة زجاجية، ورقاقة الاستشعار. يتم استخدام سطح ماء الذهب لربط مجموعة ثيول من كاشف alcanethiol. بعد ذلك، selfassembly من monolyer فسفاتيديل اكتمال تشكيل SSM.
لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM (الشكل 1). البروتين تحتوي على غشاء وSSM ثم تشكيل نظام غشاء جانب capacitively. ولذلك، إزفاء المسؤول في البروتين تحتوي على غشاء يمكن الكشف عنها بواسطة اقتران بالسعة عن طريق SSM. هذه الطريقة تعطي فقط تيارات عابرة. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. الساعة تعتمد مكعب نقلrrents يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر.
هي التي شنت على رقاقة الاستشعار في نظام كفيت (الشكل 2). كفيت لديها حجم كفيت اسطواني من 17 ميكرولتر (الحجم الصافي مع O-حلقة شنت). A دبوس الاتصال الربيع يخلق الاتصال إلى مكبر للصوت. هو مشدود موصل منفذ إلى الجزء العلوي من الجزء الرئيسي ويحمل الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة.
هي التي شنت كفيت في قفص فاراداي. توصيله إلى مسار السائل، والذي يستخدم للحث على نشاط النقل من البروتين غشاء ردا على تبادل حل سريع (الشكل 3). في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، يطلب من واحد غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة صمام على الكمبيوتر أو التبديل دليل على واجهة مربع.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. مزايا الكهربية المستندة إلى SSM بالمقارنة مع الطرق التقليدية
وقد ثبت الكهربية المستندة إلى SSM نفسها كأداة قيمة من مربع الأدوات الكهربية. انها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي لا يمكن فيها تطبيق اتفاقية الكهربية، وهي المشبك التصحيح وطرق المشبك الجهد، و: وبصرف النظر عن بعض الاستثناءات النادرة نقل البكتيرية لا يمكن التحقيق باستخدام المشبك الجهد أو أساليب المشبك التصحيح بسبب صغر حجم البكتيريا، ولأن أنها صعبة للتعبير في خلايا الثدييات أو البويضات. ولكن أيضا من الناحية الفسيولوجية نقل الثدييات ذات الصلة يمكن التحقيق. في هذه الحالة الكهربية المستندة إلى SSM جذابة للنقل من أغشية الخلايا وللتطبيقات الفحص في اكتشاف المخدرات بسبب متانة وقدرته على التشغيل الآلي.
SSM-basedUsing التقليدية الكهربية، والوقت توصيف حل من TRANSPorters يمثل تحديا. منذ دوران ناقلات منخفضة A 'التصحيح العملاقة' أو مطلوب التكوين 'خلية كاملة "، والتي يكون لها القرار وقت منخفضة بطبيعتها في تجربة تبادل الحلول. ويمكن التغلب على المضاعفات باستخدام الإفراج الركيزة التحلل الضوئي. ومع ذلك، هي مناسبة فقط لعدد محدود من ركائز لهذا النهج. هنا تبادل حل سريع في SSM يوفر فرصة فريدة لإجراء دراسات الكهربية مع قرار الأوان باستخدام ركائز التعسفي.
2. القيود والخطوات الحاسمة
وعلى النقيض من المشبك التصحيح وتقنيات المشبك الجهد، لا يمكن الكهربية المستندة إلى SSM استخدامها لتطبيق المحتملة. ولذلك يقتصر توصيف نقل لنقل وسائط التي لا تعتمد على غشاء المحتملة.
بشكل عام، الكهربية المستندة إلى SSM لا يوجد لديه قيود تتعلق بنوع الناقل (كهربي). ولكن CL الجهديمكن أن أساليب المشبك أمبير أو التصحيح لديها مزايا، إذا كانت هناك حاجة مكونات داخل الخلايا مثل البروتينات ملزمة حصول على وظائف البروتين.
يمكن أن تنشأ القيود، إذا تبادل حل يخلق تيارات قطعة أثرية كبيرة. يحدث هذا عندما يتفاعل بقوة مع الركيزة SSM مثل في حالة مركبات محبة للدهون. ضوابط قطعة أثرية يمكن استخدامها لتصحيح الإشارات المقاسة. خلفية عالية من الملح علاوة على ذلك في جميع مخازن قياس يمكن استخدامها للحد من القطع الأثرية. ولكن في حالات، حيث حجم قطعة أثرية مشابه لإشارة البروتين، فإنه يكاد يكون من المستحيل عزل إشارة ذات صلة البروتين من القطع الأثرية. لحسن الحظ، والتحف عالية غير عادية في تبادل حل الأمثل.
هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح في تجربة الكهربية المستندة إلى SSM. إعداد نموذج البروتين هو الجزء الأكثر أهمية. إذا تم استخدام proteoliposomes، تأكد من أن reconsعملية titution غلة نظيفة، عينة استنساخه من LPR كافية ونقل هو المنحى في الطريق الصحيح. وLPR يمكن فحصها من قبل تجميد كسر المجهر الإلكتروني والتوجه تجربة ELISA إذا كانت الأجسام المضادة المتاحة.
لا تستخدم سوى SSM مما يدل على المعلمات الأمثل لاحتضان العينة البروتين. حقن هذا البروتين هو خطوة حاسمة أخرى. صوتنة ضروري وينبغي تجنب فقاعات الهواء أثناء الحقن. بعد مرور فترة الحضانة عينة القياسات نفسها هي الحاسمة، لأن فقاعات الهواء سيزيل عينة بروتين كثف من رقاقة الاستشعار. لذلك دائما إزالة فقاعات الهواء بعد تغيير الحلول. ومع ذلك يمكن أن يحدث المتهدمة إشارة. لتصحيح ممكن المتهدمة إشارة، فإنه من الضروري لإنجاز الضوابط المتهدمة أثناء التجربة.
3. الأنظمة المتخصصة
يمكن تعديل الإعداد SSM وفقا لتطبيقه. وعلاوة على ذلك رهنا مختلفة تماما الاجهزة درجة عالية من التخصص المتاحة،.
هناك إمكانية لقياس إشارات البروتين في ظل ظروف غير متكافئة، على سبيل المثال في إطار التدرج درجة الحموضة. لإنشاء التراكيب العازلة غير المتكافئة داخل وخارج proteoliposomes حل ثالثا، الحل يستريح، لابد من عرضه وهذا يتطلب تكوين Exchange مزدوجة. هنا لا بد من وضع صمام ثلاثي إضافية التبديل بين حلول غير تفعيل ويستريح.
لزيادة دقة الوقت للنظام وضعنا مسارا تدفق البديلة تفتقر إلى صمام محطة، ولكن باستخدام نوع مختلف من كفيت. هنا يقع على تقاطع تفعيل وحل غير تفعيل داخل كفيت، 3 ملم أمام SSM. هذا الإعداد هو مناسبة تماما لتحليل الحركية من عمليات النقل السريعة. ويمكن أن يتبين من ذلك أن القرار وقت منخفضة تصل إلى 2 ميللي ثانية هو ممكن.
و التجاريةمع ully تتوفر النظم الآلية تهدف إلى إنتاجية أعلى بكثير لفحص المخدرات. وحدة منقولة بجمع الحلول ويحقن لهم على سطح جهاز الاستشعار في لوحات 96 بئر في شكل وحة microtiter القياسية.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر J. جارسيا لسيلما، أنا سميرنوفا وR. Kaback من أجل التبرع لقياسات المزركشة وE. بامبرج للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة.
Materials
| Materials | |||
| Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
| Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
| 2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
| Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
| Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
| Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| 100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
| O-rings | Seal Science Inc. | ||
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
| Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
| Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
| Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Amplifier | Keithley | 427 | |
| Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
| USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
| Regeants | |||
| 1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
| Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
| n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
| Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
| Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
| α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |
Riferimenti
- Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
- Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
- Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
- Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
- Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
- Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochimica. 49, 6115-6121 (2010).
