Rapid Kolorimetriske Analyser til kvalitativt Skille RNA og DNA i biomolekylære Prøver

Mye av cellebiologi skjer via molekylære interaksjoner som involverer DNA og RNA. ⁴ Disse naturlig forekommende nukleinsyrer (NAS) interagerer med hverandre, ⁵ med proteiner, ⁶ og med en rekke små-molekyl forbindelser og ligander in vivo (f.eks, divalente kationer ^7). Interaksjonene kan være kort eller lang levetid (kinetisk), kan variere fra høy til moderat til lav affinitet (termodynamisk styrke), og kan også oppvise betydelig variasjon i kjemiske egenskaper og spesifisitet – noen foreninger er ganske spesifikke (f.eks DNA · · · transkripsjonsfaktorer, RNA · · · skjøting faktorer), mens andre interaksjoner er nødvendigvis langt mer generisk (f.eks DNA · · · bakterielle histone-lignende HU proteiner ^8). Uspesifikke interaksjoner med NAs kan ha praktiske konsekvenser for in vitro forsøk med blandinger av biomolecules, som det er mulig, og selv sannsynlig, at noen NAs vil assosiere med biomolekyler av interesse, i det minste under noen delsett av de eksperimentelle betingelser som er brukt (ionestyrke, pH, osv.).

Se for eksempel, fremstilling av et protein av interesse (POI) via heterolog over-ekspresjon av det rekombinante protein i Escherichia coli cellekultur; slik prosedyre blir rutinemessig utført i praktisk talt hvilken som helst strukturell biologi lab ⁹ Ved utarbeidelse for ytterligere eksperimenter, slik. som biokjemiske / biofysisk karakterisering, krystallisering osv.., innledende innsats generelt fokus på å skaffe en tilstrekkelig mengde av POI i så ren form som mulig, helst som en kjemisk homogen og biophysically monodisperse prøven. Etter avbrudd i vertsceller, de tidlige stadiene av en typisk rensing arbeidsflyt som mål å isolere POI fra E. coli proteiner, nukleinsyrer, cellevegg rusk,og andre komponenter av den cellulære lysatet. Imidlertid kan verten NAs samtidig rense med POI for flere fysiokjemiske grunner – en svært grunnleggende POI kan ikke-spesifikt pull-down vert DNA / RNA, POI kan ha en generisk NA-bindende aktivitet (f.eks nevnte HU); POI kan være en ganske bestemt NA-bindende protein, men utstillingen kryssreaktivitet med vert RNA eller DNA'er, vert NAs kan interagere med en kromatografi matrise og derved bare ko-eluer med POI, og så videre. Kritikkløs, høyaffinitetsbinding av vert NAs til en POI kan utgjøre en vexing problem fordi NA urenheter vil trolig påvirke nedstrøms eksperimenter (f.eks fluorescens anisotropi analyser av POI • RNA bindende ^10). Alternativt, uforutsette POI · · · Ikke foreninger også kan sees tilfeldig, da slike interaksjoner belyse severdighetene nukleinsyre-bindende kapasitet. Uansett, om NAs er sentrale komponenter eller forurensninger, må man først kvantifisere ogidentifisere hvilken type (DNA, RNA) av co-rensing NAs i forberedelse til nedstrøms eksperimenter.

Flere analytiske metoder finnes for påvisning og kvantifisering av NAs i en prøve. De fleste av de tilgjengelige metodene er fundamentalt enten spektrofotometrisk (f.eks en ₂₆₀ absorbansverdier og en ₂₆₀ / A ₂₈₀ forholdstall), fluorometrisk (f.eks binding av tiazolring oransje eller andre fluorescerende fargestoffer til NA), eller kolorimetrisk (følsomhet nukleosider til kjemiske reaksjoner at avkastning kromoforer absorberende i UV-vis område av det elektromagnetiske spektrum), som nylig er beskrevet av De Mey et al. ¹ er imidlertid avgjørende skritt å identifisere hvilken type polynukleotid som RNA eller DNA utenfor rammen av mange av disse kvantifisering tilnærminger. Her har vi gi et sett av kolorimetriske assays for å raskt identifisere hvilke typer NA komponenter i et proteinholdig prøve.

Protokollene er beskrevet her cen effektivt utført uten ytterligere trinn for å isolere de potensielle NA urenheter, og stole på Benedicts analysen for reduserende sukker ^11, den orcinol analysen for pentoser ^12,13, og difenylamin reaksjoner ^14,15 av 2'-deoxypentoses (figur 1 og 2) . Benedikt test (Figur 2a) utnytter evnen av den lineære, åpen-kjede (aldehyd) form av en aldose sukker å redusere Cu ^{2 +,} med samtidig oksydasjon av sukkeret er karbonyl til et karboksylat gruppe og produksjon av Cu ₂ O som en uløselig rød bunnfall. Denne reaksjonen vil teste positivt med frie reduserende sukker som aldoses og ketoses (som omdanner de tilsvarende aldoses via enediol mellomprodukter), men ikke med pentose sukker som er låst inn i syklisk form som en del av det kovalente ryggraden av et DNA-eller RNA-polynukleotidet. På grunn av den minimalistiske kravet av en fri hemiacetal funksjonalitet, andre compounds som kunne tester positiv i denne analysen – og derfor fungere som potensielle interferents – inkluderer α-hydroksy-ketoner og korte oligosakkarider (f.eks disakkaridet maltose). Både Bial største orcinol (Figur 2b) og Dische største difenylamin (figur 2c) reaksjoner er basert på innledende ødeleggelse av polynukleotidet ryggraden, via depurination av nukleosid og ytterligere syre-eller base-katalysert hydrolyse av de overordnede nukleotider, for å gi furan-2 -karbaldehyd (furfural) derivater, og disse derivater reagerer med enten en polyhydroksy fenol eksempel orcinol (Bial største) eller difenylamin (Dische tallet) reagenser for å danne fargede kondensasjonsprodukter av meste ukjent kjemisk struktur. DNA versus RNA Spesifisiteten til Dische s analysen stammer fra det faktum at den pentose sukker må være 2'-deoxygenated for å være utsatt for oksidasjon til ω-hydroxylevulinyl aldehyd, som videre reagerer med difenylaminunder sure betingelser for å gi en lys blå kondensat (Figur 2c). Bruke strømlinjeformede protokollen beskrevet her, har vi funnet at disse sukker-spesifikke kolorimetriske reaksjoner kan skille mellom RNA og DNA, og vil også indikere tilstedeværelse av frie reduserende sukker som glukose, fruktose, eller ribose i biomolekylære prøve.