I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

Organelli intracellulari sono strutture altamente dinamiche con diversa forma e composizione, che sono sottoposti a stimoli intrinseci ed estrinseci delle cellule-specifiche. Le loro membrane sono spesso giustapposti a siti di contatto definiti, che diventano centri per lo scambio di molecole di segnalazione e dei componenti della membrana ^1,2,3,4. Le inter-organelli microdomini di membrana che si formano tra il reticolo endoplasmatico (ER) ei mitocondri all'apertura del IP3-sensibili Ca ^{2 +} sono noti canali come i mitocondri associato-ER membrane o MAMS ^4,5,6. La proteina / lipide composizione e le proprietà biochimiche di questi siti di contatto di membrana sono stati ampiamente studiati in particolare in relazione al loro ruolo nella regolazione intracellulare Ca ^{2 + 4,5,6.} La ER serve come fonte principale di Ca ^{2 +} intracellulare, e in questa capacità regola una miriade di processi cellulari a valle di Ca ^{2 +} segnalazione, including post-traduzionale folding delle proteine ​​e proteine ​​maturation7. Mitocondri, invece, mantenere l'omeostasi Ca ^{2 +,} tamponando citosolico Ca ^{2 +} concentrazione impedendo così l'apertura di percorsi apoptotici a valle di Ca ^{2 +} squilibrio ^4,8. La natura dinamica delle MAMs li rende luoghi ideali di base per analizzare i meccanismi cellulari, tra cui Ca ^{2 +} di segnalazione e regolazione di mitocondriale Ca ^{2 +} sopravvivenza concentrazione, la biosintesi dei lipidi e dei trasporti, il metabolismo energetico cellulare e ^{4,9,10,11,12.} Diversi protocolli sono stati descritti per la purificazione di questi microdomini di tessuto epatico e cellule coltivate ^13,14.

Assunzione di metodi precedentemente pubblicati in considerazione, abbiamo adattato un protocollo per l'isolamento dei mitocondri e MAMs dal cervello di topo adulto. Per questa procedura, abbiamo aggiunto un ulteriore passaggio di purificazione, cioè un estrazione Triton X100, che enables l'isolamento del glicosfingolipide arricchito microdomini (GEM), frazione dei MAMs. Queste preparazioni GEM condividere componenti proteiche diverse con zattere caveolae e lipidi, derivati ​​dalla membrana plasmatica o altre membrane intracellulari, e si propone di funzionare come la raccolta punti per il raggruppamento delle proteine ​​recettori e per interazioni proteina-proteina ^4,15.