Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation
Summary
Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren Nervenstammzellen
Abstract
Neurale Stammzellen (NSCs) säumen die postnatale Seitenventrikel und führen zu mehreren Zelltypen, die Neuronen, Astrozyten und Ependymzellen 1 enthalten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für NSC Selbsterneuerung, Engagement und Differenzierung ist entscheidend für die Nutzung der ihr einzigartiges Potenzial, um das Gehirn zu reparieren und besser zu verstehen Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Bisherige Verfahren zur Manipulation von Säugersystemen erforderte die zeitaufwendig und teuer Bestreben der Gentechnologie am Ganztier Ebene 2. Somit haben die meisten Studien die Funktionen des NSC-Molekülen in vitro oder di wirbellosen erforscht.
Hier zeigen wir die einfache und schnelle Methode, um Neugeborenen NPCs, die als Neugeborene subventrikulären Zone (SVZ) Elektroporation bezeichnet manipulieren. Ähnliche Techniken wurden vor einem Jahrzehnt zu embryonalen NSCs zu studieren entwickelt und unterstützt Studien über cortical Entwicklung 3,4. In jüngerer Zeit wurde dies angewendet zu studieren die postnatale Nager Vorderhirn 5-7. Diese Technik führt zu robusten Kennzeichnung von SVZ NSCs und deren Nachkommen. So bietet postnatalen SVZ Elektroporation eine Kosten-und Zeitaufwand effektive Alternative für Säugetierzellen NSC Gentechnik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier im Einzelnen die Technik der neonatalen SVZ Elektroporation, eine Technik, um schnell und robust beschriften und manipulieren SVZ Stammzellen und deren Nachkommen. Es gibt mehrere Vorteile, die Elektroporation im Vergleich zu anderen Techniken aufweist. Erstens, da der Schwerpunkt Markierung von Zellen, ist man in der Lage zu Zelle autonom und nicht zellautonomen Effekte zu erkennen. Zweitens genetischen Manipulation unter Verwendung induzierbare Systeme ermöglicht es, Effekte vor oder nach Integration synaptische…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (Idea Development Award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stammzell-Stipendium (AB), und eine National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF) unterstützt. Das vorliegende Material basiert auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovations, Inc. hatte die Geldgeber keine Rolle in der Studie, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
Riferimenti
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
