곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경
Summary
우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을 설명<em> 칸디다 알비 칸스</em대 식세포에 의해> phagocytosis. 이 방법은 대 식세포 마이그레이션, 인식, engulfment과 phagosome 성숙의 단계 별 분석을 사용하고 phagocytosis의 소설 측면을 알 수있다.
Abstract
곰팡이 병원균 등 일반적으로 미생물의 Phagocytic 간격은 4 개의 독특한 스테이지로 구성되어 고려 될 수있다 : 병원균이있는 사이트에 phagocytes의은 (i) 이전, 패턴을 통해 병원체 – 관련 분자 패턴 (PAMPs)의 (II) 인식 인식 수용체 (PRRs), 식세포 세포막에 바인딩 된 미생물의 (III) engulfment, 그리고 성숙 phagosomes 및 섭취 입자의 소화에서 빨아 세포 (IV) 처리. 전체 phagocytosis를 평가 연구 1, 2, 3, 4, 5 유익한이다, 그러나 일반적으로 differentially에 영향을 줄 수 있습니다 마이그레이션, engulfment 및 phagosome 성숙로 과정을 파괴하지 않는 점에서 제한됩니다. 또한, 이러한 연구는 단일 이벤트로,보다 지속적으로 동적 과정으로 이해를 신고 할 수 있습니다. 우리는 최근 고급 라이브 세포 이미징 기술을 개발하고, 모두의 유전자 기능 분석과 이들을 통합 한병원체와 호스트 세포는 타고난 면역 세포 기능과 곰팡이 pathogenesis의 분석을위한 크로스 징계 플랫폼을 만들 수 있습니다. 이 연구는 인간의 phagocytes과 곰팡이 병원균에 더 일반적으로 전염성 미생물의 분자와 세포의 상호 작용 체계 시간적 분석을 사용하여 관찰 할 수 phagocytosis의 소설 측면을 공개했습니다. 예를 들어, 우리는 다음을 정의하기 시작했습니다 (A) 세포 표면의 구성 요소는 인식, engulfment 및 곰팡이 세포 1, 6, 7, 8, 9, 10의 살해 과정의 각 단계에 필요한, (b)는 얼마나 표면 형상 대 식세포의 이해와 효모와 hyphal 세포 7 살해의 효율성에 영향을 미친다, 그리고 (c) engulfment는 세포주기와 대 식세포 9, 10의 행동의 변화로 연결하는 방법.
하나의 시점 스냅 샷 대조적으로, 라이브 셀 비디오 현미경은 공동으로 연구 할 호스트 세포와 병원균의 다양한 수셀 마이그레이션, 복제 및 기공을 갖는 거래 등의 동적 프로세스의 넓은 범위에 공간과 시간적 정보를 제공 긴 기간 동안 ntinuous 시퀀스. 여기 호스트 및 곰팡이 세포를 준비하는, 비디오 현미경 실험을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 다른 phagocytes 및 미생물과 미래 연구를위한 사용자 가이드를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음은 대 식세포의 phagocytosis를 공부하는 라이브 세포의 비디오 현미경의 사용에 대한 방법을 설명합니다. 비디오 현미경 분석에 대한 정보의 여러 추가 레이어를 제공합니다. 하나의 기본 장점은 이해 데이터가 6 시간 관찰 기간 동안 어떤 시점에 (하나의 실험에서) 생성 할 수 있다는 것입니다. 더 중요한 것은, 설명 방법은 phagocytosis의 각 단계의 차등 분석을 할 수 있습니다. 우리는 예를 들어, 표시 한 그 C.의 전반적인 이해의 변화 대 식세포 세포 라인과 기본 식세포에 의한 알비 칸스의 글리코 실화와 morphogenesis의 돌연변이는 세포 세포 접촉 한 대상 셀 또는 engulfment의 속도에 대한 대 식세포의 이동의 변화 7 설립 중 결과가 될 수 있습니다.
이러한 실험을 실시 할 때 피해야 할 함정에는 여러가지가 있습니다. 첫째, 실험 proce에 걸쳐 안정된 환경 조건을 보장하기 위해 매우 중요합니다dure. 이것은 가장 몇 시간 실험을 시작하기 전에 실험 조건으로 설정되어 환경 챔버에 달성된다. 비디오 품질은 Z-위치에 관계없이 따라서 수동 초점 수정에 대한 필요성을 제거 기계적 또는 열 변경 자동으로 샘플을 유지하기 위해 적외선 레이저를 사용하여 정교한 모듈에 크게 의존합니다.
실험의 확장 특성을 감안할 때, 그것은 낮은 노출 시간을 용이하게 높은 형광 마커를 채용하여 최소화 할 수 있습니다 레이저 빛에 노출과 관련 photobleaching과 photoconversion 효과를 제한하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 FITC 염색 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있습니다. FITC는 바와 같이 매우 밝고 안정적인 얼룩, 낮은 노출 시간이 필요하며이 오랜 시간 경과 영화에 대한 FITC 이상적입니다. 그러나, 우리는 정기적으로 Calcofluor 화이트와 PKH 염료뿐만 아니라 태그 생물을 포함하여 다른 대상 얼룩의 다양한 사용합니다.
<p c아가씨 = "jove_content"> 우리의 출판 작업의 대부분은 넓은 필드 현미경을 사용하여 검색을 수행하지만, 노출이 더 회전하는 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 우리의 손에이 시간 경과 3D 영상 현미경에 대한 필수적입니다하여 최소화 할 수 있습니다.본 연구 동안 이미지는 6 시간의 phagocytosis 분석 이상 1 분 간격으로 촬영되었다. 이미지 사이의 간격은 조사중인 프로세스에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 기공을 갖는 인신 매매와 같은 빠른 프로세스를 조사 할 때 예를 들어, 간격이 감소 될 수있다. 최소 시간 간격은 현미경과 카메라 사양에 의해 제한됩니다. 타이밍을 조정하면 명심 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 첫째, 스냅 샷 사이의 간격을 조절하면 적은 포인트가 이미징 될 수 있으며, 파일 크기가 상당히 증가 할 것이라는 것을 의미합니다. 반대로, 너무 많은 이미지 간격을 증가하면 동영상이 연속성을 잃게 할 것입니다.
이 접근 방식은 적용 할 수 있습니다원칙적으로 다른 병원체와 호스트 세포를 죽음의 이해를 공부합니다. 예를 들어, 최근 sialoadhesin – 결핍 생쥐에서 뼈 골수 유래 대 식세포이 크게 sialylated 캄 필로 박터 속 jejuni 8 구속력과 phagocytosis 감소 전시 것으로 나타났습니다. 이미지 분석 대상 셀 크기의 감소와 점점 더 어려워진다 그러나 대상 크기는 가능성의 중요한 결정자입니다. 정교한 이미지 분석 소프트웨어는 빠른 비디오 현미경 분석을 위해 필수적이며,이은 7 개별 셀 및 전체 세포 인구의 이주를 공부하는 알고리즘의 생성을 촉진하기 위해 적절한 생물 정보학 지원과 결합해야합니다. 마이그레이션 및 개인 대 식세포 – C.albicans 상호 작용의 분 별 분 분석을위한 정교한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 라이브 셀 비디오 현미경은 C.의 복잡성에 독특한 통찰력을 제공합니다 macrophag로 알비 칸스 phagocytosis에스. 다른 병원체와 phagocytes을 (수지상 세포, 호중구) 공부하고, 더 자세하게 또는 상피 및 내피 세포 레이어와 같은 더 많은 생리 표면에 이미지 셀 셀의 상호 작용에 3D 비디오 현미경을 개발하기 위해이 방법을 확장 할 무한한 잠재력이 있습니다. 이 기술은 호스트 병원체 상호 작용의 연구에서 도구의 다음 세대의 일부입니다 및 동적 프로세스의 광범위한에 대한 자세한 공간과 측두엽 정보를 생성하는 데 도움이됩니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE는 스코틀랜드의 수석 임상 연구원이며, 최고 과학자 사무소 (SCD/03)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 LPE (089930)에 웰컴 트러스트 프로젝트 기금의 지원을받는되었다. NARG은 웰컴 트러스트 프로그램 기금 (080088)과 장비 부여 (075470) (DeltaVision 용), 의해 FP7 – 2007-2013 기금 (건강-F2-2010-260338 – ALLFUN)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 도움 지원과 조언을 특정 케빈 맥켄지의 애버딘 (Aberdeen) 영상 시설의 대학, 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
Riferimenti
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