Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour l'évaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular
Summary
Un essai d'hémolyse ne peut être utilisée comme rapide, à haut débit écran de cytocompatibilité systèmes d'administration de médicaments et de l'activité de la livraison des marchandises endosomolytique intracellulaire. Le test mesure la perturbation des membranes des érythrocytes en fonction du pH de l'environnement.
Abstract
Bicouches de phospholipides qui constituent endo-lysosomal vésicules peuvent constituer un obstacle à la livraison de médicaments biologiques à des cibles intracellulaires. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de transporteurs de drogues synthétiques ont été conçus pour une perturbation active de la membrane de l'endosome et livrer de la marchandise dans le cytoplasme. Ici, nous décrivons le test d'hémolyse, qui peut être utilisé aussi rapide et à haut débit pour l'écran et l'activité cytocompatibilité endosomolytique des systèmes de délivrance de médicaments intracellulaires.
Dans l'essai d'hémolyse, des globules rouges humains et des matériaux de test sont co-incubés dans des tampons à des pH définies, qui imitent extracellulaires début endosomes, et la fin de l'endo-lysosomiaux environnements. Après une étape de centrifugation à granulés de globules rouges intacts, la quantité d'hémoglobine libérée dans le milieu est mesurée par spectrophotométrie (405 nm pour la gamme plus dynamique). La perturbation pour cent des globules rouges est ensuite quantifié par rapport au contrôle positif sampLes lysées avec un détergent. Dans ce système, le modèle de la membrane du globule rouge sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Le résultat souhaité est l'hémolyse négligeable à pH physiologique (7,4) et une hémolyse robuste dans la gamme de pH endo-lysosomal d'environ 5 à 6,8 pH.
Introduction
Bien qu'il existe de nombreux potentiels à fort impact cibles thérapeutiques à l'intérieur de la cellule, la délivrance intracellulaire d'agents pose un défi de taille. Souvent, les médicaments, les produits biologiques, en particulier sont internalisés par les cellules et la traite dans des vésicules qui soit conduire à une dégradation de leur contenu par la voie endo-lysosomal, ou la navette de retour hors de la cellule par exocytose. 1 Dans ce dernier procédé, le pH interne des vésicules est acidifiée à environ 5-6, qui est le pH optimal pour l'activité des enzymes qui agissent dans ce compartiment, tel que le lysozyme. 2
Récemment, un certain nombre de matériaux ont été spécialement conçues pour tirer parti de l'acidification des endosomes pour faciliter la distribution cytosolique de leur cargaison. Un exemple de cette approche utilise des nanoparticules de polymères synthétiques, des micelles dont l'activité principale est zwitterionique et charge neutre au pH physiologique (c. 7.4). Cependant, à pH 6,0- 6,5, les polymères deviennent protonés et acquérir une charge positive nette qui déstabilise le noyau des micelles, et les segments de polymère exposées interagir avec et désorganiser la membrane de l'endosome. Cette activité a été montré pour favoriser l'évasion endosomal des peptides et des acides nucléiques thérapeutiques à base leur permettant d'accéder à leurs cibles cytosoliques. 3,4 D'autres exemples de méthodes élaborées pour servir de médiateur évasion endosomal qui perturbent la barrière de la membrane comprennent fusogènes '«peptides ou protéines qui peuvent médier la fusion membranaire ou transitoire formation de pores dans la bicouche phospholipidique. 5 Homopolymères de anioniques acides acryliques d'alkyle tels que le poly (acide propylacrylique) sont une autre approche bien étudiée, et dans ces polymères, l'état de protonation de l'acide carboxylique pendant dicte transition dans un hydrophobe, membrane interruption de l'État dans des gammes de pH endo-lysosomal. 6,7
Un système modèle utile pour le criblage comportement endosomolytique est l'ex dépendante du pH in vivo hémolyse dosage. 8 Dans ce système modèle, la membrane érythrocytaire sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Ce modèle généralisable a été utilisé par d'autres pour évaluer le comportement endosomolytique des peptides de pénétration cellulaire et d'autres polymères de systèmes de transfert de gènes. 8-11 Dans cette expérience, les globules rouges humains et matériels de test sont co-incubées dans des tampons à des pH définis qui imitent extracellulaires (7,4), au début des endosomes (6,8), et la fin de l'endo-lysosomal (<6,8) environnements. La quantité d'hémoglobine libérée au cours de la période d'incubation est quantifié comme une mesure de la lyse des globules rouges, qui est normalisée à la quantité d'hémoglobine libérée dans les échantillons témoins positifs lysées avec un détergent.
De criblage d'une petite bibliothèque de matériaux d'essais potentiellement endosomolytiques, on peut en déduire que les échantillons qui produisent aucune hémolyse à pH 7,4, mais l'ourlet significativement élevéolysis à pH <6,5, seront les candidats les plus efficaces et cytocompatible pour l'administration de médicaments cytosolique. Les matériaux qui répondent à ces critères on peut s'attendre à rester inerte et non pas aveuglément détruire membranes bicouches lipidiques (c. qui pourrait provoquer une cytotoxicité) avant d'être exposé à une baisse du pH local après internalisation dans l'endo-lysosomal compartiments.
Dans ce protocole, les érythrocytes sont isolés à partir d'un donneur humain et co-incubée à pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 avec expérimentales endosomolytiques agents de délivrance de médicaments. Érythrocytes intacts sont culottées, et les surnageants (contenant de l'hémoglobine libérée des érythrocytes lysés) sont analysés pour l'absorbance caractéristique de l'hémoglobine par l'intermédiaire d'un lecteur de plaque (figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
pH-sensible polymères ou d'autres agents conçus pour fonction endosomolytique peut être rapidement et efficacement sélectionnés en fonction de lyse des globules rouges à des valeurs de pH rencontrées dans l'endosome (figure 1; pH 6,8 – endosome précoce, pH 6,2 – endosome tardif, pH 5,6 – lysosome). 14-17 dépendante du pH hémolyse a été utilisé pour cribler la capacité des transporteurs à la médiation de libération de médicaments endosomal biomacromolecular (pepti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le financement par l'intermédiaire du ministère de la Défense dirigé par le Congrès programmes de recherche médicale (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) et l'American Heart Association (# 11SDG4890030).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
Riferimenti
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochimica. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
