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Medicina

Una novela Vertebral Método de Estabilización para Producir contuso Lesiones de la Médula Espinal

Published: January 05, 2015
doi:
10.3791/50149
, , , , ,
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman and Campbell Brain and Spine,Indiana University School of Medicine, 2Medical Neuroscience Graduate Program,Indiana University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology,Indiana University School of Medicine, 4Norton Neuroscience Institute,Norton Healthcare

Summary

Estabilización vertebral es necesaria para minimizar la variabilidad, y para la producción de lesiones de médula espinal experimentales consistentes. Utilizando un aparato de estabilización personalizado en combinación con el dispositivo impactador NYU / Mascis, hemos demostrado aquí el equipo y el procedimiento adecuado para la generación de cervicales (C5) de lesiones de la médula reproducibles-hemi contusa espinal en ratas adultas.

Abstract

Lesión de la médula espinal cervical animales clínicamente relevante modelos (SCI) son esenciales para desarrollar y probar terapias potenciales; Sin embargo, la producción de SCI cervical confiable es difícil debido a la falta de métodos satisfactorios de estabilización vertebral. El método convencional para estabilizar la columna es suspender la columna cervical rostral y caudal a través de abrazaderas unidas a las apófisis espinosas cervicales. Sin embargo, este método de estabilización no evitar que el tejido rendimiento durante la contusión como los procesos espinales cervicales son demasiado cortos para ser asegurado de manera efectiva por las abrazaderas (Figura 1). Aquí presentamos un nuevo método para estabilizar completamente la vértebra cervical en el mismo nivel de la lesión por impacto. Este método minimiza eficazmente el movimiento de la columna vertebral en el lugar de impacto, lo que mejora en gran medida la producción de LIC consistentes. Proporcionamos descripción visual de los equipos (Figura 2-4), el métodos, y un protocolo paso a paso para la estabilización de la vértebra cervical 5 (C5) de ratas adultas, para realizar la laminectomía (Figura 5) y producir una SCI contundente a partir de entonces. Aunque sólo demostramos un hemi-contusión cervical usando el dispositivo impactador NYU / Mascis, esta técnica de estabilización vertebral se puede aplicar a otras regiones de la médula espinal, o ser adaptada a otros dispositivos SCI. Mejora de la exposición de la médula espinal y la fijación a través de la estabilización vertebral puede ser valioso para la producción de lesiones consistentes y fiables a la médula espinal. Este método de estabilización vertebral también se puede utilizar para inyecciones estereotáxicas de células y trazadores, y para la formación de imágenes usando microscopía de dos fotones en diversos estudios neurobiológicos.

Introduction

Fuerza mecánica consistente y replicable en el tejido de la médula meta es esencial para minimizar la variabilidad funcional e histológico y para el establecimiento de modelos exitosos lesión medular contusa (SCI) 1-7. La cantidad de fuerza aplicada a una región diana de la médula espinal depende de los métodos utilizados para la estabilización de la columna vertebral. Desplazamiento posicional de la columna vertebral de destino durante el contacto entre el émbolo impacto y la médula espinal altera la fuerza de lesión resultante. El modelo SCI contusa cervical es un modelo más clínicamente relevante que otras formas de SCI, ya que aproximadamente 50% de los casos de SCI humanos se producen en este nivel 8, y varios estudios SCI se han realizado utilizando modelos de lesión cervical animales 9-14. Aunque los modelos contundentes SCI utilizan a menudo alguna forma de estabilización por pinzamiento de la anterior procesos espinales y posterior al sitio de la lesión, esta preparación es difícil para la producción de SCI cervical. Y# 160; Como se muestra en esta demostración, el método de estabilización que hemos desarrollado es ventajoso en su capacidad de aumentar tanto la calidad y la reproducibilidad de lesión por contusión. En particular, este método de estabilización vertebral se estableció en un intento de enmendar las deficiencias y desafíos de otros modelos: 1) la variabilidad en vertebral ceder bajo la fuerza del impacto se puede producir mediante la sujeción apófisis espinosas dorsales adyacentes rostral y caudal a la laminectomía. El grado de desplazamiento vertebral depende del número de articulaciones vertebrales entre el impacto y las vértebras está estabilizada (Figura 1). Por lo tanto, los más articulaciones involucradas menos estable es la columna vertebral se vuelve; 2) los procesos dorsal espinosa son la insuficiencia abrazadera frágil y causa como resultado de la fractura de la apófisis espinosa o la abrazadera deslice fuera del proceso; y 3) las apófisis espinosas sobre estas vértebras son extremadamente cortos entre el C3 a T1 vértebras en comparación con los de la verte torácicabrae, lo que dificulta el uso de abrazaderas tradicionales para captar las apófisis espinosas para la estabilización de la columna cervical.

Aquí se describe un nuevo método para estabilizar la columna vertebral para producir C5 contundente SCI en mujeres adultas ratas Sprague-Dawley. Este método puede ser utilizado para la estabilización de los otros niveles de la columna vertebral y la médula espinal, y conjugados bien con otros dispositivos SCI contundentes, incluyendo el cable de la New York University / Multicéntrico Animal Spinal Injury Study (NYU / Mascis) impactador 15 (Figura 2) , Sistemas de Precisión e Instrumentación, LLC Infinito Horizon (IH) dispositivo 16, la Universidad Estatal de Ohio / electromagnética Lesión Medular dispositivo 1, y del Aparato Louisville Sistema de Lesiones (LISA) 17, lo que permite un amplio uso en la investigación de SCI.

Protocol

1. La exposición de la cervical espinal Láminas Limpie la superficie quirúrgica con etanol al 70%, previamente calentada con una almohadilla térmica. Cubra la superficie con un paño quirúrgico estéril antes de colocar una gasa estéril, hisopos de algodón, y las herramientas quirúrgicas tratado al autoclave en el área de la cirugía. Utilice un esterilizador microbead para inter-cirugía de esterilización de instrumentos quirúrgicos. Anestesiar la rata con ketamina (87,7 mg / kg) / xilazina (12,3 mg / kg) por vía intraperitoneal (IP). El plano adecuado de la anestesia se alcanza cuando el animal deja de responder a un estímulo pizca dedo del pie. Por vía subcutánea inyectar 0,01-0,05 mg / kg de buprenorfina y 5 mg / kg carprofeno antes del procedimiento quirúrgico. La buprenorfina debe entonces ser administrada cada 8 a 12 horas y Carprofeno una vez al día, durante los primeros 4-7 días después de la cirugía. Aplicar pomada protectora a los ojos de los animales para prevenir el secado de la córnea durante la cirugía. Afeitar el área quirúrgica en el dorsalsuperficie de la rata de la región torácica media a la parte posterior de la cabeza con una maquinilla. Retire la piel afeitada usando una aspiradora equipada con un filtro HEPA. Aplique una solución de betadine a la zona afeitada como un lavado quirúrgico luego limpie el área con un 70% toallitas con alcohol isopropílico. Utilice una hoja de bisturí para realizar una incisión en la línea media de 3-4 cm en la piel de la base de la cabeza caudalmente hasta mediados de tórax. Identificar la línea media de la fascia y los músculos subcutáneos anterior a la glándula hibernación en la parte inferior del cuello; cortan el trapecio y otros músculos a lo largo de la línea media para reducir la hemorragia. Encuentra la línea media de dos regiones del tejido adiposo subyacente a los músculos; cortar los músculos paravertebrales caudalmente estrictamente a lo largo de la línea media, y las capas musculares separados usando un pequeño retractor de tejido hasta que el nivel de la T2 torácica se alcanza apófisis espinosa. Identificar y cortar el músculo conectado a la apófisis espinosa T2 utilizar this estructura como un punto de referencia anatómica. Retire la punta cartilaginosa de la apófisis espinosa T2 para mejorar la visibilidad de las vértebras cervicales. Separar los músculos paraespinales lateralmente desde las apófisis espinosas y las láminas de C4-T1; Sin embargo, sobra el músculo que cubre la lámina C3 para evitar la hemorragia. Cortar los músculos más de las láminas de C4-T1 lateralmente hacia las facetas en ambos lados de la columna vertebral. Después de la médula láminas están expuestos, colocar el animal en su superficie ventral en el canal en forma de U del estabilizador. Identificar la vértebra C5 contando las apófisis espinosas rostral de la señal T2 a T1, C7, C6, y finalmente C5. 2. La estabilización de las vértebras y Realización de la lesión por impacto Coloque los dos brazos de acero inoxidable del estabilizador para suspender el animal mediante la colocación de los bordes serrados de los brazos debajo de la lateral facetas del C5-6 vértebras (Figura 1C). Después de asegurar los brazos con las vértebras en su lugar (Figura 2B), ajustar el aparato de estabilización para asegurar la columna vertebral es el nivel y centrado. Por último, bloquear los brazos apretando los tornillos del estabilizador. Cortar los ligamentos entre los procesos espinales y láminas en C4-5 y C5-6 para identificar el margen de la lámina C5. El uso de un micro-gubia, recortar distancia el medio de la lámina a la derecha en C5 como destinados a SCI (Figura 5C-E). Después de la laminectomía, transportar el animal con el estabilizador bajo el dispositivo de lesión. Asegurar el animal junto con estabilizador en un montaje (Figura 3A-C) para alinear con precisión el émbolo en el objetivo de la médula espinal usando un micro-manipulador lateral (Figura 3). En condiciones de alta magnificación, localizar las zonas de entrada de la raíz dorsal C5 y C6 (DREZs) en la superficie dorsal de la médula espinal expuesta sin durotomy. Objetivo del émbolo en el medio de las dos DREZs identificados y a medio camino entre la línea media y el borde lateral de la médula espinal (Figura 5B). Uso de un dispositivo impactador NYU / Mascis con una punta de 2,5 mm de diámetro (Figura 3A y B), producir un hemi-C5 contusión (Figura 5B & E) por una caída de 10 g varilla x 12,5 mm de altura (Figura 2A). Verifique la lesión visualmente por contusión en la médula espinal (Figura. 5E, flecha) y comprobar los parámetros de lesiones proporcionadas por el software NYU 12,17 (Figura 6). Músculos de sutura y el tejido blando con estériles de sutura vicryl 4-0, a continuación, cierre la incisión de la piel con grapas quirúrgicas (EZ Clips). Aplique un ungüento antibacteriano al sitio quirúrgico. Administrar 5,0 ml de 0,9% por vía subcutánea solución salina estéril para el animal para la hidratación. Colocar el animal en un calorambiente controlada en (recirculación padcage de agua caliente en una almohadilla de calefacción)) con comida húmeda proporcionada en la ropa de cama (cambiado a diario), y una botella de agua con un largo tubo de salida para un fácil acceso colocado en el suelo de la jaula. Brindar atención para asegurar una adecuada recuperación antes de devolver el animal a la jaula. Como se trata de una lesión contusa cervical unilateral, el animal probablemente perderá la función de la extremidad anterior ipsilateral, de forma transitoria, que comienza a recuperarse durante las primeras semanas después de la lesión. Sin embargo, la función contralateral debe permanecer intacto, por lo que el animal debe ser capaz de comer y beber sin deterioro, y sólo tienen deterioro menor en la locomoción y el aseo personal.

Representative Results

Al seguir este protocolo, consistente y reproducible cervical hemi-contusa SCI es producida (Figura 5 y 6). El uso de un estabilizador vertebral para estabilizar los procesos laterales de la misma vértebra en el nivel previsto para SCI permite tales resultados satisfactorios. Usando este método, no sólo la vértebra C5 objetivo, sino también C4 adyacente y C6 están fijados rígidamente. El software de NYU / Mascis ofrece una lectura con un gráfico situado en una x y el eje y, y es compatible con el uso de nuestro método de estabilización vertebral, y el equipo (Figura 6). Este método de estabilización reduce la variabilidad lesión que puede resultar de el desplazamiento hacia abajo del tejido diana y la columna vertebral (Figura 1). Después de una lesión, una clara hematoma azulado unilateral centrado entre el C5 y C6 DREZs es visible (Figura 5E). Estos parámetros de lesiones son consistentes de animal a animal de acuerdo con la lectura proporcionada por el software NYU / Mascis (Figura 6). A medida que el hemi-contusión cervical produce déficits extremidades anteriores claros, este modelo es ideal para la evaluación de las extremidades anteriores capacidades funcionales tales como alcanzar, el aseo 13, y la manipulación de objetos 18-19. Como déficits motores miembros posteriores son menos prominentes, la Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) ​​locomotor escala de puntuación 4 no es apropiado para su uso en este modelo. El resultado funcional después de una lesión es más notable en los déficits extensores pata ipsilateral, en el que la rata exhibe un "engarrotados" puño con todos los dígitos flexionado 18. Todos los animales expuestos a la misma gravedad de la lesión y el nivel de la médula espinal deben exhibir déficits similares a la extremidad anterior ipsilateral se ilustra en este protocolo, después de la lesión correcta. Animales heridos incorrectamente pueden presentar muy diferente manifestación y la duración de los déficits 13,18. Histológicamente, este modelo produce grandes daños materia gris y blanca en el epicentro lesión y rostral y caudal al sitio de la lesión, lo que lleva a una considerable formación de la lesión y de la cavidad contenida casi exclusivamente dentro de la parte lesionada de la médula espinal. Una gran forma una cicatriz glial, principalmente astrocitos basado en los bordes de la lesión con la muerte neuronal masiva 18. Figura 1: Ilustración de flexibilidad columna vertebral durante SCI contusa con diferentes métodos de sujeción. Figuras A y B muestran la flexibilidad o "rendimiento" de la columna vertebral cuando apófisis espinosas se sujetan dorsal, lo que permite impactos indebidos y datos inconsistentes. La ilustración muestra en una muestra mucha más flexibilidad al momento del impacto (línea roja discontinuay grandes flechas curvas) en comparación a la mostrada en B (flechas curvas más pequeñas), como las abrazaderas están más lejos del sitio de laminectomía y lesiones. La figura C muestra la estabilización lateral con nuestro dispositivo descrito con el brazo estabilizador bien apretado bajo la apófisis transversa de la vértebra donde se realizará el lugar del impacto. No hay flexibilidad de la columna vertebral durante este procedimiento, ya que la vértebra de interés está completamente estabilizado. Figura 2: NYU / Mascis impactador y el recipiente estabilización personalizado. Figura A muestra las partes y características del dispositivo de lesión de la médula espinal NYU / Mascis, con múltiples ajustes de altura varilla de gravedad de la lesión (recuadro). Figuras B y C ilustran el recipiente en forma de U que tiene larata, y los brazos de estabilización dentada que forma segura estabilizan la columna vertebral durante la cirugía y lesión (diseñado y producido por Zhang YP). Figura 3: Sistema y microadjuster lateral de montaje personalizado del impactador NYU / Mascis figura A se detallan los diferentes componentes del sistema de montaje a medida para el estabilizador de ratas en forma de U para lesiones de la médula espinal.. Tenga en cuenta la microadjuster lateral en la figura A, que es crucial para la alineación precisa de la médula espinal de rata de lesión. Figuras B y C proporcionar más representación del estabilizador sin (B) y con el recipiente de rata en forma de U (C) con respecto a otra importante componentes del dispositivo de la lesión (sistema de montaje diseñados y producidos por YP Zbloquea). Figura 4:. Las mediciones de los componentes individuales del dispositivo de estabilización quirúrgica y los archivos adjuntos Cada componente del sistema de estabilización de encargo se pone de relieve para mostrar las dimensiones y la escala (A, C, y D). Brazos de estabilización Torácica (B) se muestran para mostrar la aplicación potencial de este dispositivo para su uso en diferentes modelos quirúrgicos espinales. Figura 5: Señales quirúrgicos y preparación para la lesión de la médula espinal hemi-contusión cervical. Figuras A y B representan los puntos de referencia correctos para impa adecuadaalineación ct en la rata expuesta la médula espinal. El punto de impacto adecuado es directamente entre las raíces C5 y C6 dorsales de los nervios (rostral-caudal) y la línea media y los bordes laterales de la médula espinal (B). Las figuras muestran CE, en un aumento mayor, el proceso de exponer el medio deseado de la cervical de la médula espinal de lesiones, a través de laminectomía unilateral cuidado. Además, las figuras D y E demuestran el cable inmediatamente antes y después de una lesión por contusión de la médula espinal. Tenga en cuenta la hemorragia visible (E) causada por el impacto (flecha negro). Figura 6 :. Ejemplos de aceptable frente a las lecturas de datos inaceptables siguientes impacto con el impactador NYU / Mascis. El gráfico superior (A) y conjunto de datos superior (C) </strong> ilustran una lectura de un muy buen impacto, con mediciones de datos de "% de error" para velocidad de impacto varilla, altura inicial, y hora de inicio, como se indica con la flecha roja y subrayado. Todos los valores están muy por dentro de la ventana de error aceptable. Por el contrario, el panel inferior demuestra datos producidos por un impacto inadecuada causada por la estabilización inadecuada de la columna vertebral (B) y el error durante la "reducción a cero" de la varilla de impactador y la punta sobre la superficie de la médula espinal, antes de ajustar la altura de la varilla impactador (C). Tenga en cuenta el error considerable indicado para la altura inicial y la hora de inicio de la caída de impactador, como se indica por la flecha roja y subrayado. El software también proporciona una advertencia de que el error se ha detectado para estos parámetros (parte inferior del panel C).

Discussion

Aquí hemos demostrado un método de estabilización de la columna cervical para la producción unilateral contundente SCI en C5. Este método de estabilización aumenta la precisión del trauma anatómicamente y produce consistente déficits funcionales 13,18. En otros modelos que dependen de sujeción dorsal de las apófisis espinosas, el riesgo de daño apófisis espinosa o desprendimiento de las abrazaderas de la vértebra es bastante alto. Estos modelos también pueden permitir considerable desplazamiento de la columna vertebral y rendimiento de la fuerza de contusión y la naturaleza flexible de la columna vertebral y las columnas vertebrales (Figura 1A y B). El tejido produciendo altera el tiempo de contacto del émbolo de tejido y resulta en vigor lesión impredecible (Figura 1A-B & 6B). Nuestra estabilización vertebral descrito también proporciona otros beneficios para la preparación quirúrgica: 1) este método se estabilice completamente las vértebras C5 con centro en el marco delmicroscopio quirúrgico que aumenta la precisión de la laminectomía (Figura 1C); 2) el animal montado dentro del estabilizador en forma de U se puede tomar directamente desde la ubicación quirúrgica para la fijación de montaje personalizado, lo que evita el procedimiento de volver a montar el animal en dispositivos SCI y ahorra tiempo; y 3) la estabilización de las vértebras a nivel de la lesión y dorsal directamente y caudal al sitio previsto de lesión puede disminuir en gran medida el movimiento del cuerpo causada por la respiración, otra medida para reducir la variabilidad.

La principal ventaja de la utilización de este método de estabilización es la cantidad reducida de rendimiento, o movimiento ventral de la médula espinal y de la columna en el impacto. Basado en la física simple de una lesión por contusión, la fuerza y ​​la energía del impacto se transferirán de la varilla a la médula espinal, idealmente con el cable de absorber esta energía en el lugar de impacto. Sin embargo, si los rendimientos de la columna vertebral debajo de la cuerda, como es posibleen el método de sujeción espinosa dorsal (Figura 1A y B), la fuerza real aplicada a la cuerda disminuye y variable, dependiendo del grado de rendimiento.

Aunque este video ilustra el procedimiento completo de un modelo SCI contusa cervical, la esencia de este artículo es la introducción del método de estabilización de la columna que usamos en diversas aplicaciones en nuestro laboratorio, específicamente para los estudios de SCI. Una versión modificada de este dispositivo de estabilización y el método se ha utilizado en los ratones SCI 23. Este sencillo método de estabilización de la columna es de gran utilidad para la investigación de SCI, y hemos utilizado anteriormente este método y equipo para realizar contusión torácica, así como modelos SCI laceración. Otro laboratorio ha descrito recientemente una variación de este tipo de estabilización de la lesión cervical en esta revista 22. En resumen, presentamos este nuevo método de estabilización vertebral a varios Surgicprocedimientos de Al para generar reproducible SCI experimental que van desde laminectomía a la producción de la lesión. Los beneficios de este dispositivo de estabilización no se limitan a contusión de la médula espinal cervical, ya que este método de estabilización ha sido adaptado para una amplia variedad de experimentos tales como inyecciones intra-espinal, trasplante celular, recolección de LCR desde la cisterna magna, hemisección y transección lesiones, contusiones torácicas, en imágenes in vivo empleando microscopía de dos fotones, y la médula registro electrofisiológico. El aumento de la calidad de los procedimientos quirúrgicos y lesión de la columna y la reducción de la variabilidad experimental ayudará a proporcionar una idea de los verdaderos mecanismos de la lesión y la recuperación, y detectar los efectos de diferentes terapias en el trastorno devastador de SCI.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud [NS36350, NS52290, y NS50243 a X-MX]; Fondo de Dotación George Mari Hulman; el Estado de Indiana; y un Premio Ruth L. Kirschstein Nacional de Investigación Servicio (NRSA) 1F31NS071863 para CLW

Materials

Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132
Dukal Gauze Sponges Fisher Scientific 22-415-490 
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Webster Veterinary 07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 
Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261
Antiobiotic Ointment Webster Veterinary 07-877-0876
Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific 1006015
Rongeur Fine Science Tools 16000-14
Surigical Scissors Fine Science Tools 15009-08
Scissors (blunt dissection) Fine Science Tools 14040-10
Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
Large Forceps Fine Science Tools 11024-18
Fine Forceps Fine Science Tools 11223-20
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade #15 Fisher Scientific 10015-00
EZ Clips Fisher Scientific 59027
Sterile sutures Fine Science Tools 12051-10
Instrument Sterilizer Fine Science Tools 14040-10
Surgical Stabilizer Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet) Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device Custom Manufactured W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience
Rutgers, The State University of New Jersey
e-mail: impactor@biology.rutgers.edu
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Walker, M. J., Walker, C. L., Zhang, Y. P., Shields, L. B. E., Shields, C. B., Xu, X. A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (95), e50149, doi:10.3791/50149 (2015).
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