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Medicina

A Novel vertebrale metodo di stabilizzazione per la produzione di Contusivi Cord Injury spinale

Published: January 05, 2015
doi:
10.3791/50149
, , , , ,
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman and Campbell Brain and Spine,Indiana University School of Medicine, 2Medical Neuroscience Graduate Program,Indiana University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology,Indiana University School of Medicine, 4Norton Neuroscience Institute,Norton Healthcare

Summary

Stabilizzazione vertebrale è necessario per ridurre al minimo la variabilità, e per la produzione di lesioni del midollo spinale sperimentali coerenti. Utilizzando un dispositivo di stabilizzazione personalizzato in collaborazione con il dispositivo di simulazione NYU / Mascis, abbiamo dimostrato qui l'attrezzatura adeguata e la procedura per la generazione riproducibili cervicali (C5) le lesioni del midollo spinale emi-contusivo in ratti adulti.

Abstract

Clinicamente rilevanti cervicale lesioni del midollo spinale degli animali (SCI) modelli sono essenziali per sviluppare e testare potenziali terapie; Tuttavia, producendo affidabile SCI cervicale è difficile a causa della mancanza di metodi soddisfacenti di stabilizzazione vertebrale. Il metodo convenzionale per stabilizzare la colonna vertebrale è di sospendere la colonna cervicale rostrale e caudale via morsetti collegati ai processi spinosi cervicali. Tuttavia, questo metodo di stabilizzazione non impedire il tessuto cedevole durante la contusione come i processi spinali cervicali sono troppo breve per essere efficacemente protetto dalle pinze (Figura 1). Qui si introduce un nuovo metodo per stabilizzare completamente i vertebra cervicale allo stesso livello della lesione impatto. Questo metodo riduce efficacemente il movimento della colonna vertebrale nel sito di impatto, che migliora notevolmente la produzione di SIC coerenti. Forniamo descrizione visiva delle apparecchiature (Figura 2-4), il metodos, e un protocollo passo-passo per la stabilizzazione della vertebra cervicale 5 (C5) di ratti adulti, effettuare laminectomia (Figura 5) e producono un SCI contundente successivamente. Anche se abbiamo solo dimostriamo un emi-contusione cervicale utilizzando il dispositivo di simulazione NYU / Mascis, questa tecnica di stabilizzazione vertebrale può essere applicato ad altre regioni del midollo spinale, o essere adattato ad altri dispositivi SCI. Migliorare l'esposizione del midollo spinale e la fissazione per la stabilizzazione vertebrale può essere utile per la produzione di ferite compatibili e affidabili al midollo spinale. Questo metodo di stabilizzazione vertebrale può essere utilizzato anche per iniezioni stereotassica di cellule e traccianti, e per l'imaging mediante microscopia a due fotoni in vari studi neurobiologici.

Introduction

Coerente e replicabile forza meccanica sul bersaglio tessuto spinale è fondamentale per ridurre al minimo la variabilità funzionale e istologiche e per stabilire efficaci lesioni del midollo spinale contusivo (SCI) modelli 1-7. La quantità di forza applicata ad una regione bersaglio del midollo spinale dipende dai metodi utilizzati per la stabilizzazione della colonna vertebrale. Spostamento di posizione della colonna di destinazione durante il contatto tra lo stantuffo impatto e il midollo spinale altera la forza conseguente pregiudizio. Il modello di contusivo SCI cervicale è un modello più clinicamente rilevante rispetto ad altre forme di SCI, in quanto circa il 50% dei casi SCI umani si verificano a questo livello 8, e diversi studi SIC sono stati condotti utilizzando animali modelli di lesioni cervicali 9-14. Sebbene i modelli contusivi SCI spesso utilizzano una qualche forma di stabilizzazione fissando anteriore e posteriore processi spinali al sito della lesione, questa preparazione è difficile per la produzione SCI cervicale. &# 160; Come mostrato in questa dimostrazione, il metodo di stabilizzazione abbiamo sviluppato è vantaggioso nella sua capacità di aumentare sia la qualità e la riproducibilità di lesioni contusione. In particolare, questo metodo di stabilizzazione vertebrale è stata istituita nel tentativo di modificare le carenze e le sfide di altri modelli: 1) variabilità vertebrale cedere sotto la forza d'urto può avvenire fissando dorsali adiacenti processi spinosi rostrale e caudale alla laminectomia. Il grado di spostamento vertebrale dipende dal numero dei giunti vertebrali tra l'impatto e le vertebre è stabilizzata (Figura 1). Pertanto, i più articolazioni coinvolte la meno stabile la colonna vertebrale diventa; 2) i processi dorsali spinoso sono guasti morsetto fragili e causare come risultato di frattura processo spinoso o morsetto sfilamento del processo; e 3) i processi spinosi su queste vertebre sono estremamente brevi tra C3 a T1 vertebre rispetto a quelle del verte toracicaBrae, il che rende difficile utilizzare morsetti tradizionali per cogliere i processi spinosi per stabilizzare la colonna cervicale.

Qui si descrive un nuovo metodo di stabilizzazione della colonna vertebrale per la produzione di C5 contusivo SCI in femmina adulta Sprague-Dawley. Questo metodo può essere utilizzato per la stabilizzazione di altri livelli della colonna vertebrale e del midollo spinale, e coniugati e con altri dispositivi contusivi SCI, incluso il cavo di New York University / Multicenter Animal Spinal Injury Study (NYU / Mascis) urto 15 (figura 2) Sistemi di precisione e Strumentazione, LLC Infinite Horizon (IH) dispositivo 16, Ohio State University / elettromagnetica Spinal Cord Injury dispositivo 1, e l'Apparato Louisville sistema Injury (LISA) 17, consentendo l'uso diffuso nella ricerca SCI.

Protocol

1. L'esposizione della cervicale spinale Lamine Pulire la superficie chirurgica con il 70% di etanolo, pre-riscaldato con una piastra elettrica. Coprire la superficie con un telo chirurgico sterile prima di garza sterile, tamponi di cotone, e strumenti chirurgici autoclavato nell'area chirurgia. Utilizzare uno sterilizzatore microperla per inter-chirurgia sterilizzazione di strumenti chirurgici. Anestetizzare ratto con ketamina (87,7 mg / kg) / xilazina (12,3 mg / kg) per via intraperitoneale (IP). Il corretto piano di anestesia è raggiunto quando l'animale cessa di rispondere ad uno stimolo pinch punta. Sottocutanea iniettare 0,01-0,05 mg / kg buprenorfina e 5 mg / kg Carprofen prima procedura chirurgica. La buprenorfina deve quindi essere somministrato ogni 8-12 ore e Carprofen una volta al giorno, per i primi 4-7 giorni dopo l'intervento. Applicare una pomata protettiva per gli occhi dell'animale contro l'essiccamento della cornea durante un intervento chirurgico. Radere l'area chirurgica sulla dorsalesuperficie ratto dalla regione mediotoracico alla parte posteriore della testa con tagliaunghie. Rimuovere pelliccia rasata utilizzando un vuoto equipaggiato con un filtro HEPA. Applicare soluzione betadine alla zona rasata come una macchia chirurgico poi pulire la zona con il 70% cotone imbevuto di alcol isopropilico. Utilizzare un bisturi per eseguire 3-4 cm incisione mediana nella pelle dalla base della testa caudalmente a metà torace. Identificare la linea mediana della fascia e muscoli sottocutanei anteriori alla ghiandola letargo al collo inferiore; tagliare il trapezio e altri muscoli lungo la linea mediana per ridurre l'emorragia. Trovare la linea mediana di due regioni di tessuto adiposo sottostante i muscoli; tagliare muscoli paraspinali caudalmente strettamente lungo la linea mediana, e strati muscolari separati usando un piccolo divaricatore tissutale finché il livello del processo spinoso toracico T2 è raggiunto. Identificare e tagliare il muscolo collegato al processo spinoso T2 utilizzare thiStruttura s come un punto di riferimento anatomica. Rimuovere la punta cartilaginea del processo spinoso T2 per migliorare la visibilità delle vertebre cervicali. Separare i muscoli paravertebrali lateralmente dai processi spinosi e lamine di C4-T1; Tuttavia, risparmiare il muscolo copre sulla lamina C3 per impedire il sanguinamento. Tagliare i muscoli sopra lamine da C4-T1 lateralmente verso le sfaccettature sui due lati della colonna vertebrale. Dopo le lamine vertebrale sono esposti, posizionare l'animale sulla sua superficie ventrale nel canale a forma di U dello stabilizzatore. Identificare la vertebra C5 contando i processi spinosi rostralmente dal punto di riferimento T2 a T1, C7, C6, e, infine, C5. 2. Stabilizzazione Le vertebre e Esecuzione Injury Impact Posizionare i due bracci in acciaio inox di stabilizzatore di sospendere l'animale posizionando i bordi dentellati delle braccia sotto il lateral sfaccettature del C5-6 vertebre (Figura 1C). Dopo aver fissato i bracci con vertebre in posizione (figura 2B), regolare il dispositivo di stabilizzazione per garantire la colonna vertebrale è piana e centrata. Infine, bloccare le braccia stringendo le viti dello stabilizzatore. Tagliare i legamenti tra i processi spinali e lamine a C4-5 e C5-6 identificare il margine della lamina C5. Utilizzando un micro-rongeur, agganciare distanza metà della lamina sulla destra al C5 come previsto per SCI (Figura 5C-E). Dopo laminectomia, trasportare l'animale con lo stabilizzatore sotto il dispositivo di lesioni. Fissare l'animale con stabilizzante su un supporto (Figura 3A-C) per allineare con precisione lo stantuffo sul bersaglio midollo spinale usando un micro-manipolatore laterale (Figura 3). In alto ingrandimento, individuare le zone di ingresso delle radici dorsali C5 e C6 (DREZs) sulla superficie midollo spinale dorsale esposta senza durotomy. Mirare il pistone al centro dei due DREZs individuati e metà strada tra la linea mediana e il bordo laterale del midollo spinale (Figura 5B). Uso di un dispositivo di simulazione NYU / Mascis con una punta diametro di 2,5 mm (Figura 3A e B), produrre un emi-C5 contusione (Figura 5B e E) da una altezza di caduta 10 g stelo x 12.5 mm (Figura 2A). Verificare il danno visivamente lividi sul midollo spinale (Fig. 5E, freccia) e controllare i parametri di pregiudizio forniti dal software NYU 12,17 (Figura 6). Muscoli di sutura e dei tessuti molli con sterile 4-0 Vicryl sutura, quindi chiudere l'incisione cutanea con graffette chirurgiche (Clips EZ). Applicare una pomata antibatterica al sito chirurgico. Somministrare 5,0 ml di sterile allo 0,9% per via sottocutanea salina per l'animale per l'idratazione. Posto l'animale in un caloreambiente controllata al (ricircolo padcage acqua calda su una piastra elettrica)) con il cibo umido previsto sulla biancheria (cambiati ogni giorno), e una bottiglia di acqua con un lungo beccuccio per un facile accesso posto sul pavimento della gabbia. Fornire assistenza per garantire un adeguato recupero prima di tornare l'animale alla gabbia di casa. Poiché si tratta di una unilaterale cervicale lesioni contusivo, l'animale probabilmente perde la funzione dell'arto anteriore ipsilaterale, transitoriamente, che inizia a recuperare nel corso delle prime settimane dopo la lesione. Tuttavia, la funzione controlaterale dovrebbe rimanere intatto, così l'animale deve essere in grado di mangiare e bere senza valore, e solo di valore minore in locomozione e governare.

Representative Results

Su seguendo questo protocollo, coerente e riproducibile cervicale emi-contusivo SCI viene prodotto (Figura 5 e 6). L'uso di uno stabilizzatore vertebrale per stabilizzare i processi laterali della stessa vertebra a livello destinato SCI permette tali risultati soddisfacenti. Utilizzando questo metodo, non solo la C5 vertebra bersaglio, ma anche C4 adiacente e C6 sono rigidamente fissate. Il software NYU / Mascis fornisce un read-out con un grafico impostato su un x ed y, e supporta l'utilizzo del nostro metodo di stabilizzazione vertebrale, e attrezzature (Figura 6). Questo metodo di stabilizzazione riduce la variabilità pregiudizio che può derivare dalla spostamento verso il basso del tessuto bersaglio e della colonna vertebrale (Figura 1). A seguito di infortunio, una chiara ematoma bluastro unilaterale centrato tra la C5 e C6 DREZs è visibile (Figura 5E). Questi parametri lesioni sono coerenti da animale ad animal secondo la lettura fornito dal software NYU / Mascis (Figura 6). Come la cervicale emi-contusione produce deficit degli arti anteriori chiari, questo modello è ideale per la valutazione degli arti anteriori capacità funzionali, quali il raggiungimento, governare 13, e oggetto di manipolazione 18-19. Come deficit motori arti posteriori sono meno prominenti, il Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) ​​locomotoria scala di punteggio 4 non è adatto per l'uso in questo modello. Il risultato funzionale a seguito di infortunio è più evidente nei deficit zampa estensori omolaterale, in cui il topo presenta una "bastonato" pugno con tutte le cifre flesso 18. Tutti gli animali esposti allo stesso gravità del pregiudizio e del livello del midollo spinale dovrebbe mostrare deficit simili a dell'arto anteriore ipsilaterale illustrato in questo protocollo, su lesioni corretto. Animali feriti impropriamente possono presentare con molto diverse manifestazioni e la durata dei deficit 13,18. Istologicamente, questo modello produce ingenti danni grigia e sostanza bianca all'epicentro pregiudizio e rostrale e caudale al sito di lesione, che porta a una notevole formazione di lesioni e cavità contenuta quasi esclusivamente nella parte lesa del midollo spinale. Un grande, soprattutto astrociti-based forme cicatrice gliale alle frontiere lesione con massiccia morte neuronale 18. Figura 1: Illustrazione di flessibilità della colonna vertebrale durante SCI contusivo con diversi metodi di serraggio. Figure A e B spettacolo flessibilità o "resa" della colonna vertebrale quando i processi spinosi sono bloccati dorsale, consentendo effetti impropri e dati incoerenti. L'illustrazione mostrata in A mostra una maggiore flessibilità in caso di impatto (linea rossa tratteggiatae grandi frecce curve) rispetto a quello mostrato in B (frecce curve più piccole), come i morsetti sono più lontano dal sito di laminectomia e lesioni. Figura C mostra stabilizzazione laterale con il nostro dispositivo descritto con il braccio stabilizzante serrato saldamente sotto processo trasversale la vertebra dove verrà eseguita sito di impatto. Non vi è alcuna flessibilità della colonna vertebrale durante questa procedura, come la vertebra di interesse è completamente stabilizzato. Figura 2: NYU / Mascis urto e contenitore di stabilizzazione personalizzati. Figura A mostra le parti e le caratteristiche del dispositivo di lesioni del midollo spinale NYU / Mascis, con diverse impostazioni di altezza asta per la gravità delle lesioni (riquadro). Figure B e C illustrano il contenitore a forma di U che contiene ilratto, e le braccia di stabilizzazione dentellati che stabilizzano saldamente la colonna vertebrale durante l'intervento chirurgico e lesioni (progettato e prodotto da YP Zhang). Figura 3: Sistema e microadjuster laterale di montaggio personalizzato sul dispositivo di simulazione NYU / Mascis Figura A dettaglio le diverse componenti del sistema di montaggio su misura per lo stabilizzatore di ratto a forma di U per le lesioni del midollo spinale.. Notare la microadjuster laterale nella figura A, fondamentale per l'allineamento preciso del midollo spinale di ratto per la ferita. Figure B e C forniscono un'ulteriore rappresentazione dello stabilizzatore senza (B) e con il contenitore di ratto ad U (C) rispetto ad altri importanti componenti del dispositivo pregiudizio (sistema di montaggio progettati e prodotti da YP Zhang). Figura 4:. Misure dei singoli componenti il dispositivo di stabilizzazione chirurgica e allegati Ogni componente del sistema di stabilizzazione personalizzato viene evidenziato per mostrare le dimensioni e la scala (A, C, e D). Bracci di stabilizzazione toracica (B) vengono mostrati per visualizzare la potenziale applicazione di questo dispositivo per l'utilizzo in diversi modelli chirurgici spinali. Figura 5: punti di riferimento chirurgiche e preparazione per emi-contusione lesioni del midollo spinale cervicale. Figure A e B ritraggono i punti di riferimento corretti per una corretta IMPAallineamento ct sul ratto esposto midollo spinale. Il punto di impatto appropriata è direttamente tra le radici C5 e C6 dorsali nervose (rostrale-caudale) e la linea mediana e bordi laterali del midollo spinale (B). Le figure mostrano CE, in ingrandimento maggiore, il processo di esposizione metà desiderata della cervicale midollo spinale per lesioni, attraverso un'attenta laminectomia unilaterale. Inoltre, figure D ed E dimostrare il cavo immediatamente prima e dopo lesioni del midollo spinale contusione. Nota l'emorragia visibile (E) causata dall'impatto (freccia nera). Figura 6 :. Esempi di accettabile contro letture di dati inaccettabili seguito dell'impatto con la simulazione NYU / Mascis. La parte superiore del grafico (A) e set di dati superiore (C) </strong> illustrano una lettura di un buon impatto, con misure di dati "% error" per velocità d'impatto asta, altezza iniziale, e ora di inizio, come indicato con la freccia rossa e sottolineare. Tutti i valori sono ben all'interno della finestra di errore accettabile. Al contrario, il pannello inferiore mostra i dati ottenuti da un impatto improprio causato dalla stabilizzazione improprio della colonna vertebrale (B) ed errore durante "azzeramento" dell'asta di simulazione e punta sulla superficie del midollo spinale, prima di impostare l'altezza dell'asta di simulazione (C). Nota la notevole errore indicato per l'altezza iniziale e il tempo di caduta di simulazione iniziare, come indicato dalla freccia rossa e sottolineano. Il software fornisce anche un avvertimento è stato rilevato che l'errore di questi parametri (fondo di pannello C).

Discussion

Qui abbiamo dimostrato un metodo stabilizzazione del rachide cervicale per la produzione unilaterale contusivo SCI a C5. Questo metodo di stabilizzazione aumenta la precisione del trauma anatomicamente e produce coerente deficit funzionali 13,18. In altri modelli che si basano sulla serraggio dorsale dei processi spinosi, il rischio di danni o processo spinoso distacco delle fascette dal vertebra è abbastanza elevato. Questi modelli possono anche permettere una notevole colonna vertebrale spostamento e cedevole dalla forza contusione e la natura flessibile della colonna vertebrale e colonne vertebrali (Figura 1A e B). Il tessuto cedendo altera il tempo di contatto pistone-tissutale e risultati vigenti danno imprevedibile (Figura 1A-B & 6B). La nostra stabilizzazione vertebrale descritto fornisce anche altri vantaggi alla preparazione chirurgica: 1) questo metodo stabilizza completamente vertebre C5 centrata sotto ilmicroscopio chirurgico che aumenta l'accuratezza di laminectomia (Figura 1C); 2) l'animale montata entro lo stabilizzatore a forma di U può essere preso direttamente dal luogo chirurgico per l'attacco di montaggio su misura, che evita la procedura di rimontare l'animale su dispositivi SCI e fa risparmiare tempo; e 3) stabilizzazione delle vertebre a livello del pregiudizio e dorsale direttamente e caudale al luogo previsto di lesione può diminuire notevolmente il movimento del corpo causate dalla respirazione, un'altra misura per ridurre la variabilità.

Il vantaggio principale di utilizzare questo metodo di stabilizzazione è la quantità ridotta di cedere, o movimento ventrale del midollo spinale e della colonna al momento dell'impatto. Sulla base semplice fisica di una contusione, la forza e l'energia dell'impatto trasferirà dallo stelo al midollo spinale, idealmente con il cavo di assorbire questa energia al sito di impatto. Tuttavia, se le rese colonna vertebrale sotto il cavo, come è possibilenel metodo di bloccaggio spinoso dorsale (Figura 1A e B), la forza effettiva applicata al cavo viene diminuito e variabili, a seconda del grado di rendimento.

Anche se il video mostra l'intera procedura di un modello di contusivo SCI cervicale, l'essenza di questo articolo è l'introduzione del metodo di stabilizzazione della colonna vertebrale che usiamo in varie applicazioni nel nostro laboratorio, in particolare per gli studi SCI. Una versione modificata del dispositivo di stabilizzazione e metodo è stato utilizzato su topi SCI 23. Questo semplice metodo di stabilizzazione della colonna vertebrale è molto utile per la ricerca SCI, e abbiamo precedentemente utilizzato questo metodo e apparecchiatura per effettuare contusione toracica e lacerazione modelli SCI. Un altro laboratorio ha recentemente descritto una variante di questa forma di stabilizzazione per le lesioni cervicali in questa rivista 22. In sintesi, si introduce il metodo di stabilizzazione vertebrale romanzo a diversi Surgicprocedure AL per la generazione riproducibile SCI sperimentale vanno dalla laminectomia alla produzione lesioni. I vantaggi di questo dispositivo di stabilizzazione non sono limitati a cervicale contusione del midollo spinale, in quanto questo metodo di stabilizzazione è stato adattato per una vasta gamma di esperimenti come le iniezioni intra-spinale, il trapianto cellulare, raccolta CSF dalla cisterna magna, emisezione e transezione lesioni, lesioni contusione toracica, imaging in vivo utilizzando la microscopia a due fotoni, e la registrazione elettrofisiologica spinale. Aumentare la qualità delle procedure chirurgiche e lesioni spinali e riducendo la variabilità sperimentale contribuirà a fornire insight in veri meccanismi di danno e di recupero, e lo schermo gli effetti di diverse terapie sulla malattia devastante di SCI.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [NS36350, NS52290, e NS50243 a X-MX]; Mari Hulman George Endowment Fund; lo Stato dell'Indiana; e Ruth L. Kirschstein Servizio Nazionale Research Award (NRSA) 1F31NS071863 a CLW

Materials

Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132
Dukal Gauze Sponges Fisher Scientific 22-415-490 
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Webster Veterinary 07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 
Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261
Antiobiotic Ointment Webster Veterinary 07-877-0876
Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific 1006015
Rongeur Fine Science Tools 16000-14
Surigical Scissors Fine Science Tools 15009-08
Scissors (blunt dissection) Fine Science Tools 14040-10
Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
Large Forceps Fine Science Tools 11024-18
Fine Forceps Fine Science Tools 11223-20
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade #15 Fisher Scientific 10015-00
EZ Clips Fisher Scientific 59027
Sterile sutures Fine Science Tools 12051-10
Instrument Sterilizer Fine Science Tools 14040-10
Surgical Stabilizer Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet) Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device Custom Manufactured W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience
Rutgers, The State University of New Jersey
e-mail: impactor@biology.rutgers.edu
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Walker, M. J., Walker, C. L., Zhang, Y. P., Shields, L. B. E., Shields, C. B., Xu, X. A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (95), e50149, doi:10.3791/50149 (2015).
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