Generatie Topisch transgene Rats door<em> In de baarmoeder</em> Elektroporatie en<em> In vivo</em> Bioluminescence Screening
Summary
Genen kunnen worden gemanipuleerd tijdens de ontwikkeling van de cortex of de hippocampus van de rat via in utero elektroporatie (IUE) op E16, om snelle en doelgerichte wijzigingen in neuronale connectiviteit mogelijk te maken voor latere studies van gedrag of neuropathologie bij volwassen dieren. Postnatale in vivo beeldvorming voor controle IUE succes uitgevoerd door bioluminescentie activerende co-getransfecteerd luciferase.
Abstract
In utero elektroporatie (IUE) is een techniek die genetische modificatie van cellen kan in de hersenen voor het onderzoeken van neuronale ontwikkeling. Tot dusver is het gebruik van IUE voor het onderzoeken gedrag of neuropathologie in de volwassen hersenen beperkt door onvoldoende werkwijzen voor het bewaken van IUE transfectie succes van niet-invasieve technieken postnatale dieren.
Voor de huidige studie, werden E16 ratten gebruikt voor IUE. Na intraventriculaire injectie van de nucleïnezuren in het embryo, plaatsing van de pincet elektroden was kritisch voor het richten ofwel de ontwikkeling cortex of hippocampus.
Ventriculaire co-injectie en elektroporatie van een luciferase gen toegelaten bewaking van de getransfecteerde cellen postnataal na intraperitoneale luciferine injectie in de verdoofde levende P7 pup in vivo bioluminescentie, met een IVIS Spectrum apparaat met 3D kwantificering software.
<pclass = "jove_content"> definitie Area van bioluminescentie kon duidelijk onderscheid tussen corticale en hippocampus electroporations en detecteren van een signaal in de lengterichting over de tijd tot 5 weken na de geboorte. Deze beeldvormende techniek liet ons toe om pups te kiezen met een voldoende aantal getransfecteerde cellen noodzakelijk verondersteld voor het activeren van biologische effecten en, later, om gedragsmatige presteren op 3 maand oud. Als voorbeeld toont deze studie aan dat IUE de menselijke volle lengte DISC1 gen in de cortex rat tot amfetamine overgevoeligheid. Gecotransfecteerd GFP kon worden gedetecteerd in neuronen per post mortem fluorescentie microscopie in cryosecties aangeeft genexpressie sprake is van ≥ 6 maanden na de geboorte.We concluderen dat de postnatale bioluminescentie beeldvorming maakt een evaluatie van het succes van voorbijgaande transfecties met IUE bij ratten. Onderzoek naar de invloed van actuele gen manipulaties tijdens neurodevelopment op de volwassen hersenen en de connectiviteit wordt aanzienlijk vergemakkelijkt. Voor veel wetenschappelijke vragen, kan deze techniek aanvullen of zelfs vervangen het gebruik van transgene ratten en zorgen voor een nieuwe technologie voor Behavioral Neuroscience.
Introduction
De ontwikkeling van de in utero elektroporatie (IUE) methode die een modulatie van genexpressie kan in de ontwikkelende hersenen is een doorbraak geweest omdat het mogelijk bestuderen neurologische met relatief gemak. 1-7 Veranderingen in de expressie van een doelwitgen in een specifieke regio hersenen tijdens de embryonale en / of perinatale ontwikkeling bij knaagdieren werden aangetoond invloed neuronale proliferatie, migratie, arborization, en connectiviteit kritisch. 8-10
Schizofrenie is een complexe psychische ziekte met acute en chronische symptomen die zijn gerelateerd aan neurologische afwijkingen 11, 12 en dus veel van de geïdentificeerde kandidaatgenen voor schizofrenie worden onderzocht op mogelijke modulerende effecten op neurologische, zoals bijvoorbeeld voor de verstoorde-in-schizofrenie -1 (DISC1) gen 13-15.
Ontwikkeling van de hersenen is regulated door genetische factoren en hun interacties met de omgeving die een rol spelen in de pre-, peri-en postnatale ontwikkeling periodes. Een belangrijke genetische risicofactor voor verschillende gedragsstoornissen is de DISC1 16 gen. DISC1 knockdown leidt tot migratie defecten in muizen 13, 17 en manipulatie van DISC1 expressie in ontwikkelingslanden cortex door IUE is aangetoond dat het gedrag van volwassen muizen 18 beïnvloeden.
Manipuleren hersenen genexpressie door IUE heeft verschillende voordelen 19 via generatie van transgene dieren lijnen. Eerst wordt de genexpressie binnen aandachtsgebieden bereikt binnen enkele weken tot maanden in plaats van verschillende generaties van fokken transgene knaagdieren lijnen. Ten tweede, compensatiemechanismen tijdens de vroege ontwikkeling dat fenotypes kunnen beschermen in-germline gemanipuleerde dieren 20 worden vermeden. Ten derde, door uitsluitend is gericht op een specifieke cel populatie of bepaald gebied van de hersenen, migratiof proliferatie verschillen rechtstreeks worden vergeleken met de niet-mutant of controle contralaterale kant als eenzijdige electroporations gekozen. Anderzijds gaat IUE niet de nauwkeurigheid van promotor aangedreven cre / lox-geïnduceerde timing van expressie slechts een subpopulatie van de cellen in een bepaald gebied wordt gericht waardoor een mozaïek soort genexpressiepatroon.
Voor vele experimentele toepassingen bij volwassen knaagdieren, een tijdelijke transfectie van een beperkt aantal cellen in een hersengebied voldoende of zelfs gewenst zijn, zodat het grote voordeel van stabiele, kiemlijn-transgene knaagdieren verwaarloosbaar. In feite, IUE is nuttig om te onderzoeken of bepaalde abnormale cellen ontwikkelden een heel netwerk van cellen of circuits kunnen beïnvloeden. Een ander voordeel kan de mogelijkheid niet cel-autonome effecten van een gen tonen vanwege de aard van het mozaïek hit. Bovendien is de generatie van transgene en knock-out ratten is nog in de kinderschoenen en het gebruikvan IUE in deze soort voor afwijkende gevolgen ontwikkeling van de hersenen te bestuderen is van groot belang.
Tot nu toe een groot obstakel gebruiken IUE onderzoeken van de interventie gevolgen die dieren volwassenen is het gebrek aan controle elektroporatie succes. Tot dusver GFP-gecotransfecteerd fluorescente neuronen in de levende pasgeboren ratten aangetoond kon niet onder een geschikte binoculaire fluorescentiemicroscoop of met fluorescentie beeldvorming van de IVIS Spectrum gedetecteerd.
Om dit probleem te omzeilen, we gecotransfecteerd een luciferase reportergen en uitgevoerd bioluminescentie beeldvorming van levende pups door 3-dimensionale (3D) kwantificering van de IUE hersengebied.
Als voorbeeld voor het aantonen van de toepasbaarheid van deze methode in een latere functionele test testen van de neurologische genetische manipulatie, een co-injectie van plasmiden die humane DISC1, luciferase en GFP in de laterale ventrikel van rattenembryo <sup> 3, gevolgd door elektroporatie met een pincet elektrode werd uitgevoerd. Hoewel fluorescentie signalen niet kon worden gedetecteerd in postnatale fase in vivo, werd een vaste bioluminescentie signaal afgeleid van luciferine metabolisme door co-getransfecteerd luciferase gen gedetecteerd tot vijf weken na de geboorte. 3D-metingen van de geëlektroporeerd hersengebied toegestaan kwantificering waarbij pups met onvoldoende of misplaatste elektroporatie werden geïdentificeerd vanaf het begin, dus, waardoor de toewijzing van IUE dieren (gen van belang en roerei) om experimentele groepen met matchende geëlectroporeerd hersenen gebieden met een lage variabiliteit . Het gebruik van volwassen ratten in IUE gedragsparadigma's werd aangetoond als een voorbeeld van het nut van dit protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze studie toont aan dat IUE geschikt is voor volwassen ratten genereren met neuronen die een transgen in een selectief gebied van de hersenen en dat als gevolg van deze interventie, deze dieren gedragsveranderingen vertonen vermelding functionaliteit van de uitgevoerde manipulatie. In deze studie, als voorbeeld, ratten overexpressie DISC1 eenzijdig een klein deel van de prefrontale cortex bleek overgevoeligheid voor amfetamine (figuur 9).
Ratten selecteren voor elektroporatie succes door in vivo bioluminescentie beeldvorming was effectief in het beheersen van de inherente variabiliteit van IUE celtransfectie en werd toegepast op groepen te genereren met een homogene IUE gebied van lage interindividuele variabiliteit voor later onderzoek.
In deze studie hebben we in staat waren om geëlectroporeerd pups uit het nest selecteren door detectie van de co-geëlektroporeerd-GFP geïnduceerde fluorescentie in het pasgeboren dier, zelfs though op hetzelfde moment en in hetzelfde dier een bioluminescentie signaal van de eveneens co-geëlektroporeerde luciferase waargenomen na luciferin injectie (Figuur 6), en het GFP-expressie neuronen waren nog steeds aanwezig in de hersenen op een leeftijd van zes maanden. We concluderen dat in de rat, de luciferase / luciferinreactie is zeer geschikt voor dieren met succesvolle geëlektroporeerd hersenen (Figuur 3) onderscheiden.
De kwantitatieve controle van IUE succes betreft de sterkte van de bioluminescentie signaal dat wordt gemeten door het tellen van fotonen binnen dezelfde belichtingstijd (figuur 3) en komt overeen met de enzymatische activiteit van co-expressie luciferase. Kleine bioluminescentie signalen zijn detecteerbaar met 100-200 tellingen van fotonen, en, bij een straling van ~ 1×10 4 fotonen / sec / cm 2 / steradiaal tonen 1.000-2.000-GFP gekleurde cellen in de histologie in de 6 maanden oude brein rat. De hoogste signaal displegde een uitstraling tot ~ 5×10 6 fotonen / sec / cm 2 / steradiaal en ~ 64.000 telt.
In de Sprague Dawley rat stam zagen we een verzwakking van de bioluminescentie signaal langsrichting met toenemende leeftijd en het signaal verdwenen na de leeftijd van P35 (figuur 4). Op dit moment weten we niet of een van beide de voorbijgaande, plasmide vector-gebaseerde expressie van luciferase vermindert, of als de bioluminescentie signaal verzwakt als gevolg van toenemende hersenen massa, of beide zijn de oorzaken voor het verdwijnen signaal. Voor deze functionele assay volwassen ratten, was de selectie voor gedragsonderzoek alleen gemaakt op basis van de locatie van het signaal, maar niet door bioluminescentie signaalsterkte.
Hoewel 3D kwantitatieve bioluminescentie toezicht toegestaan differentiatie tussen verschillende geëlektroporeerd gebieden (figuur 5), werd de nauwkeurigheid beperkt cellen in de diepte dimension van de hersenen. Figuur 6 toont een voorbeeld van een hippocampus elektroporatie waarbij de bioluminescentie meting in het 2D en het 3D beeld gaf een goede positionering van de elektroporatie. In de ontleed post mortem hersenen, werd een GFP-fluorescentie-signaal gedetecteerd op ongeveer dezelfde positie als de bioluminescentie signaal, waarbij u de juiste afstemming van de hippocampus. Maar histologie blijkt dat ook cellen in de cortex van de dorsale hippocampus was gericht (fig. 7). Dit geeft aan dat de bioluminescentie test is een nuttig instrument om positieve, IUE pups op te sporen en ook om een idee van de geëlektroporeerde gebied hebben, maar uiteindelijk kan beeldvorming niet vervangen post mortem histologie om precies te lokaliseren positief gerichte cellen.
Onze demonstratie geeft belofte voor de toepassing van de IUE technologie om subtiele gerichte manipulaties van de corticale of hippocampus hersengebieden te aberrances simuleren in c genererenortical migratie of andere neurologische gebreken die het volwassen dier kan beïnvloeden. Terwijl bilaterale elektroporatie 26 heeft het voordeel van een grotere waarschijnlijke effect op het gedrag, is er ook sterfte van embryo. Unilaterale elektroporatie werd gekozen om de twee hersenhelften vergelijken met een als een interne controle, alsmede voor het aantonen dat zelfs IUE manipuleren in een eenzijdige, klein gebied volstaat om gedrag te veranderen. IUE-geïnduceerde veranderingen in de architectuur of verbinding tussen neuronen kunnen aldus worden geïnduceerd zonder roepen een laesie en de vereiste gelijke van de te-IUE-gemanipuleerd regio met de juiste gedragstest is afhankelijk van de wetenschappelijke vraag.
Problemen oplossen
Verminderde worpgrootte Er zijn verschillende suggesties met betrekking tot het verhogen van de overlevingskansen van de IUE pups. Ten eerste, het gebruik van zeer dun glas capillairen tijdens elektroporatie om weefsel te minimaliseren lesion wordt aanbevolen. Ten tweede, niet electroporate de eerste embryo in de vaginale einde van elke uterus hoorn: dood van de eerstgeborenen embryo verhoogt de kans op een afbreken van alle andere embryo's. Ten derde, na de geboorte, moederratten doden vaak tot hun nageslacht door perinatale stress. Om extra stress te verminderen, niet beginnen met de live imaging direct na de geboorte, maar wachten tot zeven dagen.
GFP-fluorescentie detectie van de pups
Op een week na de geboorte, geen signaal van de fluorescentie door ofwel met live-verrekijker fluorescentie microscopische beeldvorming of fluorescentie beeldvorming met de IVIS Spectrum (epifluorescentie en transfluorescence modi, want GFP excitatie / emissie: 465/520 nm en 500/540 nm). Het is mogelijk dat zowel de beperkte overdracht van korte golflengte excitatie en emissie licht door weefsel zoals de schedel en de hoge autofluorescentie achtergrond van de huid te voorkomen met behulp van fluorescentie onder described omstandigheden in de rat. Zoals getoond in figuur 6, kan het luciferase signaal in het levende dier worden gedetecteerd in de hersenen ontleed (zonder schedel) en daar een fluorescentiesignaal detecteerbaar (Figuur 6D).
Differentiatie van bioluminescentie in dicht bij elkaar gelegen hersengebieden
Zelfs in de 3D afbeelding de locatie van de bioluminescentie gebied niet kan worden voorspeld tot 100%. Vooral cellen op of onder het voorspelde gebied kan ook per ongeluk worden gericht en getransfecteerd. De exacte positie moet worden gecontroleerd door post mortem (fluorescentie) histologie (zie figuur 7).
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Tracy Young-Pearse en Atsushi Kamiya voor het verstrekken van plasmiden.
Dit werk werd gefinancierd door neuron ERANET ontdekken OR en CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) aan CK, en (DE 792/2-4) aan MASS
Materials
| Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
| kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
| Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
| IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
Riferimenti
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia dello sviluppo. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103, 865-872 (2001).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
- Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
- Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder?. British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
- Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
- Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
- Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
- Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
