構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

このプロトコルは、細部私達は溶液NMRを用いた構造研究のための膜貫通（TM）ペプチドのジスルフィド安定な錯体を生成するために開発した手順を実行します。手順は、ΔtrpLE1413融合システムによってもたらされる堅牢な表現を利用しています（下記参照）と定義された組成のTMペプチド複合体は、現代の多次元NMR実験のために洗練された安定同位体標識技術を使用して生成することができます。私たちは、リンパ球活性化免疫受容体が（最近¹日）は、TMドメイン間の相互作用を介して複数の膜タンパク質サブユニットから組み立てられる方法に関する重要な新情報が明らかになったいくつかのNMR構造を決定するためにこれらの技術を採用してきた。これらの技術は、他の多くの膜タンパク質のシステムだけでなく、溶液NMRに加え下流の分析方法の広い範囲に適用されます。ここに示す例では、ネイティブのシステイン残基を利用している間自然にジスルフィド結合タンパク質を模倣する複合体を作成するために、デザインを使用しても同様に、通常、そのようなホモとのヘテロ二量体TM複合体として弱く、非共有結合性相互作用によって一緒に保持されている複合体を安定化するために設計されたジスルフィド結合を作成するのに最適です上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリータンパク質^2-4またはヘテロαβインテグリン錯体^5,6。

そのようなTMのタンパク質の脂質二重膜貫通部分に由来するもののような非常に疎水性のペプチド配列は、生化学的および生物物理学的研究のために非常に困難な課題である。標準タンパク質およびペプチド化学技術を用いて操作することは非常に困難であることに加えて、彼らはしばしば細胞に非常に有毒であり、したがって、組換え的に生成することは困難である。我々 ^7,8と他人^9-11カルボキシ末端フレームのような細菌で、このような困難なペプチド配列を発現させる重要な成功を収めている大腸菌由来ΔtrpLE1413シーケンスの修正版への融合大腸菌trpオペロン^12。この配列によってコードされるポリペプチドtrpLE〜13 kDaのは、T7プロモーターの下で高いレ​​ベルで製造することができると完全に毒性および/または不安定性に関連する問題が回避され、封入体に局在する。 trpLE配列からアミノ末端9 -ヒスチジンタグ¹³と内部メチオニンおよびシステイン残基の除去¹⁴許さtrpLE-ペプチド融合体は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、臭化シアン（CNBrを使用して消化するの添加による配列の改変）は、所望のペプチド配列を解放します。我々は、正常に、最大4つのTMのドメインを（;また、ディスカッションのセクションを参照してください^7,8および未発表の結果）が含まれている膜タンパク質の断片を表すtrpLE融合としてダース以上の異なる配列を発現させるためにこのシステムを使用している。

ザこのプロトコルでは鍵の技術革新は、構造化されていないと非常に難溶性trpLE-TMの融合を効率的に合理化されたワークフローのコンテキスト内でジスルフィド架橋することができる条件の同定である。高収量の発現、取扱い及びペプチド生成物の精製のいくつかの側面も徹底的に最適化されており、ここに示した推奨事項は、非ジスルフィド架橋（モノマー）TMペプチド製品の生産のために均等に関連しているされています。