Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones
Summary
Los astrocitos se han reconocido para ser versátiles células que participan en los procesos biológicos fundamentales que son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y la función, y la reparación del sistema nervioso central. Aquí presentamos un procedimiento rápido para obtener cultivos puros de astrocitos de ratón para estudiar la biología de esta clase importante de centrales células del sistema nervioso.
Abstract
Los astrocitos son un tipo de células abundante en el cerebro de los mamíferos, pero aún queda mucho por aprender acerca de sus características moleculares y funcionales. Astrocitos in vitro de sistemas de cultivo celular se puede utilizar para estudiar las funciones biológicas de estas células gliales en detalle. Este protocolo video muestra cómo obtener los astrocitos puras mediante el aislamiento y la cultura de una mezcla de células corticales de crías de ratón. El método se basa en la ausencia de neuronas viables y la separación de los astrocitos, los oligodendrocitos y microglia, las tres poblaciones principales de células gliales del sistema nervioso central, en cultivo. Imágenes representativas durante los primeros días de cultivo demostrar la presencia de una población de células mixtas e indicar el punto de tiempo, cuando los astrocitos se hacen confluentes y debe ser separado de microglia y oligodendrocitos. Por otra parte, se demuestra la pureza y la morfología astrocytic de astrocitos en cultivo utilizando tinciones inmunocitoquímicas para bien establecidos yrecién descrito marcadores de astrocitos. Este sistema de cultivo puede ser fácilmente utilizado para obtener los astrocitos puros ratón y el medio acondicionado de astrocitos para el estudio de diversos aspectos de la biología de astrocitos.
Introduction
Los astrocitos son un tipo de célula muy abundantes en el sistema nervioso central (SNC). La relación de los astrocitos de las neuronas es de 1:3 en la corteza de ratones y ratas, mientras que hay 1,4 astrocitos por neurona en la corteza humana 1. El interés en función de los astrocitos se ha incrementado dramáticamente en los últimos años. Una función clave de los astrocitos es su papel en la prestación de apoyo estructural y metabólico de las neuronas 2,3. Papeles recién descubiertas de astrocitos cubren un amplio espectro de funciones. Estos incluyen guiar la migración de los axones en desarrollo y los neuroblastos determinadas durante el desarrollo de 4-6, funciones en la transmisión sináptica, la fuerza de sinapsis y procesamiento de la información por los circuitos neuronales 7-9, roles en la barrera hematoencefálica (BBB) formación 10 y la integridad 11-13 y la regulación del tono vascular cerebral 14. Otra característica importante de los astrocitos es su respuesta a la lesión. Bajo condiciones patológicas astrocytES vuelven reactivos y más regular al alza la expresión de la proteína de filamentos intermedios ácida fibrilar glial (GFAP) y proteínas inhibidoras de la matriz extracelular (ECM) 15,16. Astrocitos reactivos demarcar el sitio de la lesión del tejido sano mediante la formación de una cicatriz glial, que consiste principalmente en astrocitos proteínas secretadas de ECM de la proteoglicano sulfato de condroitina (CSPG) de la familia, los principales factores que inhiben la regeneración axonal después de una lesión del SNC 15-17.
Los astrocitos se originan en gliales radiales (RG) de las células durante la embriogénesis tardía y la vida postnatal temprana. Después de especificación de astrocitos se ha producido, precursores de astrocitos migran a sus posiciones finales, en el que comienzan el proceso de diferenciación terminal. In vivo, los astrocitos parecen ser maduro tres a cuatro semanas después del nacimiento, como se indica por su morfología típica de 18,19. Una subpoblación de células RG convertir en astrocitos de la zona subventricular (tipo de células B). Both, RG y células de tipo B funcionar como astrocitos como células madre neurales (NSC) durante el desarrollo y en el adulto, respectivamente. Al igual que los astrocitos, RG y células de tipo B también expresan el transportador de glutamato específico de astrocitos (GLAST), cerebro lípido-proteína de unión (BLBP), y GFAP, lo que indica que estos marcadores no pueden ser exclusivamente utilizado para etiquetar específicamente astrocitos adultos. En contraste con los astrocitos adultos parenquimatosas, que no se dividen en el cerebro sano RG, y el tipo B muestra células tallo potencial de la célula tales como la capacidad de auto-renovación. La desregulación de los astrocitos se ha implicado en numerosas patologías, incluyendo la enfermedad de Alzheimer 20,21, enfermedad de Huntington 22, 23 enfermedad de Parkinson, síndrome de Rett 24 y enfermedad de Alexander 25. Por otra parte, los astrocitos reaccionar a todos los insultos del SNC, que conduce a la activación de astrocitos y la formación de cicatriz glial astrocytic 16,26. La cicatriz glial astrocytic que forma tr cerebro siguienteauma lesión o la médula espinal se piensa que es la barrera primer impedir la regeneración neuronal 15.
El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones purificadas de células ha sido esencial para nuestra comprensión del sistema nervioso. Los trabajos pioneros de McCarthy y de Vellis permite a los investigadores hasta la fecha para preparar cultivos casi puros de astrocitos de rata neonatal tejido 27. Se ha aprendido mucho sobre la biología de los astrocitos utilizando este método, que se presenta aquí en una forma ligeramente modificada para aislar los astrocitos corticales de ratón. Como complemento de los estudios in vivo, los astrocitos, así como el medio condicionado obtenido utilizando el descrito en el cultivo in vitro, son herramientas valiosas para obtener más ideas sobre las funciones de los astrocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí se basa en la preparación de cultivo de astrocitos a partir de cerebros de roedores neonatos, originalmente descrito por McCarthy y de Vellis en 1980 27. El método modificado del aislamiento y el cultivo de astrocitos corticales a partir de P1 a P4 postnatal cerebro de ratón se presenta aquí es rápido, los rendimientos de los astrocitos primarios puros y es altamente reproducible. Esta técnica se puede transferir fácilmente para aislar los astrocitos a partir de otras especies…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Con el apoyo de la Fundación de Becas de Postgrado Fazit a SS, el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF 01 EO 0803) en KB y la Comisión Europea FP7 subvención PIRG08-GA-2010 a 276.989, Neurex, y la beca de la Fundación Alemana para la Investigación SCHA 1442 / 3-1 ante el CS Los autores no tienen intereses financieros en conflicto.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Altro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
Riferimenti
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscienze. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
