Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse
Summary
Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.
Abstract
Gli astrociti sono un tipo di cellula abbondante nel cervello dei mammiferi, ma resta ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche molecolari e funzionali. Nei sistemi di coltura in vitro di cellule astrociti possono essere utilizzati per studiare le funzioni biologiche di queste cellule gliali in dettaglio. Questo protocollo video mostra come ottenere astrociti puri di isolamento e la coltura di cellule corticali miste di cuccioli di topo. Il metodo si basa sulla mancanza di neuroni vitali e la separazione di astrociti, oligodendrociti e microglia, le tre popolazioni principali cellule gliali del sistema nervoso centrale, in coltura. Immagini rappresentative durante i primi giorni di cultura dimostrare la presenza di una popolazione cellulare mista e indicare il timepoint, quando astrociti diventano confluenti e devono essere separati da microglia e gli oligodendrociti. Inoltre, abbiamo dimostrato la purezza e la morfologia degli astrociti di astrociti in coltura utilizzando colorazioni immunocitochimiche per la consolidata eappena descritto marcatori astrociti. Questo sistema di coltura può essere facilmente utilizzato per ottenere astrociti topo puri e astrociti terreno condizionato per studiare vari aspetti della biologia astrociti.
Introduction
Astrociti sono un tipo cellulare molto abbondante nel sistema nervoso centrale (CNS). Il rapporto tra astrociti ai neuroni è di 1:3 nella corteccia di topi e ratti, mentre ci sono 1,4 astrociti per neurone nella corteccia umana 1. L'interesse per la funzione degli astrociti è aumentato drammaticamente negli ultimi anni. Una funzione chiave degli astrociti è il loro ruolo di supporto strutturale e metabolico ai neuroni 2,3. Ruoli di recente scoperta per gli astrociti coprono un ampio spettro di funzioni. Questi includono guidare la migrazione degli assoni di sviluppo e alcuni neuroblasti durante lo sviluppo 4-6, funzioni nella trasmissione sinaptica, forza sinapsi e di elaborazione delle informazioni da circuiti neurali 7-9, ruoli nella barriera ematoencefalica (BBB) formazione 10 e 11-13 integrità e la regolamentazione del 14 tono cerebrovascolare. Un'altra caratteristica importante di astrociti è la loro risposta al danno. In condizioni patologiche astrocytes diventano reattive e upregulate ulteriormente l'espressione della proteina di filamento intermedio acida fibrillare gliale (GFAP) e inibitori della matrice extracellulare (ECM) proteine 15,16. Astrociti reattivi delimitare il luogo di ferita da tessuto sano formando una cicatrice gliale, che consiste principalmente di proteine secrete astrociti ECM del condroitin solfato proteoglicani (CSPG) famiglia, i principali fattori che inibiscono la rigenerazione assonale dopo lesione del SNC 15-17.
Gli astrociti sono originari di radiali gliali (RG), le cellule durante l'embriogenesi e all'inizio della vita post-natale. Secondo le specifiche astrociti si è verificato, precursori degli astrociti migrare verso le loro posizioni finali, dove iniziare il processo di differenziazione terminale. In vivo, astrociti sembrano essere maturi tre o quattro settimane dopo la nascita come indicato dalla loro morfologia tipica 18,19. Una sottopopolazione di cellule RG convertire in zona subventricolare astrociti (cellule di tipo B). Both, RG e le cellule di tipo B funzionano come astrociti-come le cellule staminali neurali (NSC) durante lo sviluppo e nell'adulto, rispettivamente. Come astrociti, RG e le cellule di tipo B anche esprimere la astrociti specifico trasportatore del glutammato (GLAST), lipidi del cervello-binding protein (BLBP), e GFAP, indicando che questi indicatori non possono essere utilizzati esclusivamente per etichettare specificamente astrociti adulti. In contrasto adulti astrociti parenchimali, che non si dividono nel cervello sano, RG e B tipo cellule mostra potenziale di cellule staminali, come la capacità di auto-rinnovarsi. Disregolazione di astrociti è stato implicato in numerose patologie, compreso il morbo di Alzheimer 20,21, malattia di Huntington 22, morbo di Parkinson 23, 24 Rett sindrome e malattia di Alexander 25. Inoltre, astrociti reagire a tutte insulti del SNC, portando all'attivazione astrociti e astrocitica formazione della cicatrice gliale 16,26. La cicatrice che si forma astrocitari gliale tr seguente cervelloAUMA midollo spinale o lesioni è pensato per essere la barriera principale impedire la rigenerazione neuronale 15.
Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere popolazioni purificate di cellule è stato fondamentale per la nostra comprensione del sistema nervoso. Lavoro pionieristico da McCarthy e de Vellis consente agli investigatori di data per preparare colture quasi pure di astrociti da tessuti di ratto neonato 27. Molto è stato appreso sulla biologia astrociti utilizzando questo metodo, che viene qui presentata in una forma leggermente modificata per isolare gli astrociti corticali di topo. Integrando studi in vivo, astrociti nonché mezzo condizionato ottenuto utilizzando la coltura in vitro descritto, sono strumenti utili per ottenere ulteriori approfondimenti funzioni astrociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto si basa sulla preparazione cultura astrociti dal cervello di roditori neonatali, originariamente descritti da McCarthy e de Vellis nel 1980 27. Il metodo modificato di isolamento e la coltura di astrociti corticali da P1 postnatale al cervello P4 del mouse qui presentato è veloce, rese astrociti primari puri ed è altamente riproducibile. Questa tecnica può essere facilmente trasferiti per isolare astrociti da altre specie, come di ratto o di maiale e da altre regioni del cervello, c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato dalla Fondazione Fazit Graduate borsa di studio per SS, il Ministero federale dell'Istruzione e della ricerca (BMBF 01 EO 0803) a KB e della Commissione europea sovvenzione 7 ° PQ PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, e il tedesco Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 per CS Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Altro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
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