Vi beskriver en encellet high-throughput analysen å måle cytotoksisitet av T-celler når inkubert med tumor målceller. Denne fremgangsmåten anvender en tett, elastomeriske rekke sub-nanoliter brønner (~ 100.000 brønner / array) til romlig begrense den T-celler og målceller ved definerte forholdstall og er koblet til fluorescens mikroskopi å overvåke effektor-target konjugering og påfølgende apoptose.
Kreft immunterapi kan utnytte det spesielle ved immunresponsen å målrette og eliminere svulster. Adoptive celleterapi (ACT) basert på den adoptive overføring av T-celler genetisk modifisert til å uttrykke et kimert antigen reseptoren (CAR) har vist betydelige løftet i kliniske studier 1-4. Det er flere fordeler ved å bruke CAR + T celler for behandling av kreftformer inkludert muligheten til å målrette mot MHC bundne antigener og å functionalize T-cellene for optimal overlevelse, homing og utholdenhet i verten, og endelig til å indusere apoptose av CAR + T-celler i tilfelle verten toksisitet 5.
Opptegning av optimale funksjoner CAR + T celler forbundet med klinisk effekt er avgjørende for utformingen av neste generasjon av kliniske studier. Nylige fremskritt i levende dyr avbildning som multiphoton mikroskopi har revolusjonert studiet av immunceller funksjon in vivo 6,7. Mens disse studiene har utvidet vår forståelse av T-celle funksjoner i vivo, T-celle basert ACT i kliniske studier krever behovet for å knytte molekylære og funksjonelle trekk ved T-celle preparater forinnsprøytning med klinisk effekt etter infusjon, ved å utnytte i vitro overvåking T-celle funksjoner som, cytotoksisitet og cytokin sekresjon. Standard flow-cytometri baserte analyser har blitt utviklet som bestemmer den totale funksjon av populasjoner av T-celler på enkelt-celle-nivå, men disse er ikke egnet til å overvåke konjugat formasjon og levetid eller evnen av den samme cellen å drepe flere mål 8.
Microfabricated matriser designet i biokompatible polymerer som polydimetylsiloksan (PDMS) er en spesielt attraktiv metode for å romlig begrense effektorer og mål i små volumer 9. I kombinasjon med automatisk time-lapse fluorescens mikroskopi, thousands av effektor-target interaksjoner kan overvåkes samtidig av bildebehandling individuelle brønner på et nanowell array. Vi presenterer her en high-throughput metoden for overvåking T-cellemediert cytotoksisitet på enkelt-celle-nivå som kan bredt anvendt til å studere cytolytisk funksjonaliteten av T-celler.
Vi har skissert protokollen for en high-throughput encellede cytolytisk analysen aktivert via co-inkubering av effektorer og mål i matriser av nanowells (figur 1). I tillegg til gjennomstrømming en stor fordel av teknikken er evnen til å overvåke effektor-mediert cytotoksisitet mot ønskede målceller uten behov for målcellen Engineering som i sin tur tillater bruk av autologe eller matchet / primær tumor celler som målceller. Den romlige innesperring tillater innhenting og påfølgende kloning a…
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Number R01CA174385. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over National Institutes of Health.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |