마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램
Summary
이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 – 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.
Abstract
담배 사용은 암, 심장 질환, 폐기종, 그리고 뇌졸중 등 수많은 건강 문제로 연결됩니다. 흡연에 중독 중추 신경계에 걸쳐 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)에 니코틴의 biophysical 및 셀룰러 행동에서 유래 유행 neuropsychiatric 장애입니다. 니코틴 중독과 관련된 뇌 영역에 존재하는 다양한 nAChR의 하위 유형을 이해하는 것은 중요한 우선 순위입니다.
이러한 전체 세포 패치 클램프 또는 두 전극 전압 클램프 녹음 등의 전기 생리학 기술을 채용 실험은 관심 nAChRs의 약리 특성에 유용합니다. 같은 포유류의 조직 배양 세포 또는 Xenopus laevis의 oocytes과 같은 세포 표현 nAChRs는 물리적으로 격리되어 있으며 따라서 쉽게 현대 약리학의 도구를 사용하여 공부하고 있습니다. 대상 수용체가 이미 알려진 특히 때 많은 진전은 이러한 기술을 사용하여 만들어졌습니다차 이소성 표현은 쉽게 달성했습니다. 심하게 실험실 쥐 쥐에서 채취 한 뇌 슬라이스 내의 뉴런에 : 종종, 그러나, 그것은 그들의 모국어 환경에서 nAChRs을 연구 할 필요가 있습니다. 예를 들어, 쥐 등 α4 L9'A 마우스 1 α6 L9 'S 마우스 2로 "지나치게"nAChR의 subunits을 표현, 특정 nAChR의 subunit 자신의 기능 표현을 바탕으로 뉴런의 모호 식별 할 수 있습니다. 뇌 조각의 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 녹음이 정기적으로 숙련 된 electrophysiologist에 의해 수행되어 있지만, 로컬 등 아세틸 콜린이나 뇌 슬라이스 내에 기록 된 셀 니코틴 같은 약물을 적용하는 도전입니다. superfusate에 약물의 희석은 (목욕 응용 프로그램) 빠르게 되돌릴 수 없습니다, 그리고 U-튜브 시스템은 쉽게 뇌 슬라이스와 함께 작동하도록 구성되지 않습니다.
이 논문에서, 우리는 빠르게 성인 m에 기록 된 뉴런에 nAChR – 활성화 약물을 적용하는 방법을 설명뇌 조각 ouse. 표준 전체 셀 녹음 조각의 뉴런로 만든되며, 이익의 약물로 가득 두 번째 micropipette는 기록 세포 근처의 위치로 maneuvered입니다. 약물 가득한 피펫에 가압 공기 또는 불활성 질소의 주입은 기록 세포에 피펫에서 배출되는 약물 솔루션의 작은 금액을 발생합니다. 이 방법을 사용 nAChR로 인한 전류는 밀리 초 정확도로 해결 될 수 있습니다. 약물 응용 프로그램 시간은 쉽게 변할 수 있으며, 약물이 가득한 피펫은 농도 – 반응 곡선은 단일 신경 세포를 만들 수 있도록 허용하는 새로운 피펫으로 후퇴하고 교체 할 수 있습니다. nAChR 신경 생물학의 맥락에서 설명했지만,이 기술은 뇌 조각의 뉴런의 리간드 – 개폐 이온 채널이나 수용체의 다양한 종류를 공부하는 데 유용해야합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문에서 제시하는 방법은 뇌 슬라이스 준비에 리간드 – 개폐 이온 채널 기능을 공부 폭넓게 유용합니다. 그러나, 상당히 실험 데이터이 방법을 활용에서 그 결과의 품질과 재현성에 영향을 미칩니다 요인이 있습니다. 예를 들어, evoked 전류는 약물이 가득한 피펫의 팁의 직경에 매우 민감합니다. 작은 팁 약물 솔루션, 낮은 저항을 제공하는 대형 팁이 기록 된 셀 기록 전극 사이의 gigaohm 인감를 …
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 DA030396에 의해 지원되었다. 도움이 토론과 원고의 비판에 대한 Drenan 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 미의 특별 감사는 성인 마우스 뇌 조각에 대한 조언에 대한 기술 지원 및 조나단 토마스 팅에 대한 김 버렸네.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| glucose | Sigma | G5767 |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
| thiourea | Sigma | T8656 |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
| CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
| NaCl | Sigma | S9625 |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 |
| GTP | Sigma | G8877 |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
| RC-27 Recording chamber | Warner | |
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
| Nikon FN-1 | Nikon | |
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
| Picospritzer III | General Valve Co. | |
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
| PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
Riferimenti
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscienze. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
