Trans-vivo Fördröjd överkänslighet analys för Antigenspecifikt förordning
Summary
Vi beskriver ett värdefullt diagnostiskt test som potentiellt skulle kunna användas för att avgöra om återkallande av immunsuppression efter transplantation utan förhöjd risk för transplantatavstötning. Analysen använder principerna för fördröjd överkänslighet och ger korrekt bedömning av både givar-specifika effektor och reglerande immunsvar monteras mottagare.
Abstract
Fördröjd överkänslighet svar (DTH) är en snabb in vivo manifestation av T-cell-beroende immunsvar mot ett främmande antigen (Ag) att värdens immunsystem har upplevt under den senaste tiden. DTH-reaktioner är ofta indelade i sensibiliseringsfas, med hänvisning till det ursprungliga antigenet erfarenhet, och en utmaning fas, som vanligtvis följer flera dagar efter sensibilisering. Avsaknaden av en fördröjd överkänslighet svar på en återkallelse Ag demonstreras genom hudtest ofta betraktas som ett bevis på anergi. Den traditionella DTH-analysen har effektivt använts för att diagnostisera många mikrobiella infektioner.
Trots dela liknande immuna funktioner såsom lymfocytinfiltration, ödem, och vävnadsdöd, är den direkta DTH inte en genomförbar diagnostisk teknik hos transplanterade patienter på grund av möjligheten till direkt injektion resulterar i sensibilisering för donor antigener och graft förlust. För att undvika detta problem, suseten-till-mus "trans-vivo" DTH analys utvecklades 1,2. Detta test är i grunden en överföring DTH-analys, där humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) och specifika antigener injicerades subkutant i pinnae eller trampdynan av en naiv mus och DTH-liknande svullnad mäts efter 18-24 tim 3. Den antigenpresentationen av humana antigenpresenterande celler såsom makrofager eller DCS till T-celler i kraftigt vaskulär musvävnad utlöser den inflammatoriska kaskaden och lockar mus immunceller resulterar i svullnad svar. Svaret är antigen-specifika och kräver tidigare antigen sensibilisering. En positiv donator-reaktivt DTH svar i TV-DTH-analysen visar att transplantation patienten har utvecklat en pro-inflammatorisk immun disposition mot transplantat alloantigener.
Den viktigaste egenskapen med denna analys är att det också kan användas för att detektera reglerande T-celler, som orsakar beredskapsundertryckande. Beredskapsundertryckande av enDTH minns respons i närvaro av donatorantigen är kännetecknande för transplanterade med accepterade allografter 2,4-14. Övervakningen av transplanterade för alloreactivity och reglering av tv-DTH kan identifiera en undergrupp av patienter som kan dra nytta av reduktion av immunosuppression utan förhöjd risk för avstötning eller försämrad njurfunktion.
Ett lovande område är tillämpningen av TV-DTH analys i övervakningen av autoimmunitet 15,16 och även i tumörimmunologi 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den trans-vivo DTH-analysen är en roman diagnostiskt test med en potentiell klinisk tillämpning vid bedömningen cell-medierade svar på transplantation, cancer och autoimmuna patienter. Det är värdefullt eftersom det inte bara är användbara för att övervaka recall T effektormolekyler svar, men även den kan detektera T regulatoriska svar. Ett säkert sätt att upptäcka människans DTH reglering kan förutsäga säkerheten av immunosuppression abstinens hos patienter som är kandidater för monoterapi eller tol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för bidragen från AM VanBuskirk till utvecklingen av vår förståelse av den reglerade DTH svar hos transplanterade patienter. Detta arbete stöddes NIH bidrag PO1AI084853 och R01AI066219-06, och av EU-sponsrade en studie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs& Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
Riferimenti
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the ‘tolerance assay’: In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the ‘tolerance assay’. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Cai, J., et al. Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
