Fabricação e utilização Piggy-back Multibarrel Eletrodos para<em> Em vivo</em> As manipulações farmacológicas de respostas neurais

Puxe eletrodos de vidro Puxe eletrodos de vidro Puxar eléctrodo único barril. Use vidro único barril capilar com filamento e puxar a ponta para um diâmetro de cerca de 1-2 micrómetros, comprimento do eixo de 10-12 mm, e resistência do eléctrodo correspondente de cerca de 12 MOhm (variação 5-20 MOhms) conforme medido em 0,9% de solução de NaCl. Resistências eletrodo inferior resultaria em atividade mais fundo e, portanto, mais dificuldade em isolar a atividade unitária de neurônios individuais. Para empurrar este eletrodo, usar um horizontal ou vertical com um puxador de filamentos de aquecimento ou serpentinas de aquecimento. Puxar eléctrodo multibarrel. Devido ao diâmetro muito maior do vidro multibarrel e a necessidade de uma distribuição uniforme do calor em torno do multibarrel inteiro, um extractor poderoso com uma bobina maior diâmetro de aquecimento, não um filamento de aquecimento, se necessário. Uma pipeta multibarrel tem de ser introduzido no centro do filamento de aquecimento com no contacto com a serpentina de aquecimento. Note-se que, além das pipetas de 5 barril descrito aqui, pipetas 3 barril ou 7 barril são alternativas disponíveis comercialmente. Puxar de vidro até uma ponta de pipeta de cerca de 10 micrómetros de diâmetro total, ou menos. A ponta vai ser quebrado para o diâmetro correcto no passo seguinte, de modo que o tamanho exacto da ponta é menos crítico durante o processo de puxar do que a forma geral da ponta do eléctrodo, o qual deve ser longa e relativamente fino. Referem-se a imagem na Figura 1C para a forma desejada do eléctrodo ponta. Formas de eléctrodos curtos e grossos (Figura 1B) fará com que uma quantidade substancial de danos nos tecidos quando avança para dentro do cérebro, enquanto as formas de eléctrodo muito longos e finos (Figura 1A), irá dobrar e assim torná-la difícil de quebrar a extremidade do eléctrodo para a correcta diâmetro (ver passo 2). Modificar Dicas Eletrodo Modificar pontas dos eletrodos. Antes que os dois eléctrodos podem ser coladas umas às outras, Eles têm de ser modificados. O eixo do eléctrodo único necessita de ser dobrado antes de ser ligado ao multibarrel para garantir que o eixo do conjunto do eléctrodo piggy-back acabado é o mais fino possível. Além disso, a ponta do eléctrodo multibarrel tem de ser interrompida, a fim de assegurar a resistência baixa para iontoforese. Dobre eixo de um eletrodo único barril por cerca de 20 graus. Use a chama menor bico de Bunsen possível. Típicas "pequenos" bicos de Bunsen de empresas de fornecimento padrão de laboratório criar tamanhos de chama que são grandes demais para esta aplicação. Para contornar este problema utilizar o queimador de Bunsen menor comercial e fixar uma agulha de seringa (calibre 18 ~) para o topo do queimador, e selar a ligação com cimento dental. Quando em funcionamento, a chama deve ser difícil de ver, de cerca de 5 mm ou menos de diâmetro, e cerca de 8 mm de altura. Qualquer movimento do ar na sala se apaga a chama, por isso é uma boa idéia para operar o gravador em umsala fechada, ou para utilizar escudos de vento. Mova o eletrodo único barril através da chama para dobrá-lo por cerca de 20 graus. Ter em vista que a chama do queimador de fusão do vidro para a zona de transição a cerca de 10 milímetros de distância entre a ponta do eléctrodo. Para evitar a fusão da extremidade do eléctrodo que sugerem que o eléctrodo ser mantida a cerca de 45 graus, a ponta voltada para baixo, e mover-se do eléctrodo através da chama de forma relativamente rápida. Quebre a ponta do eletrodo multibarrel. Para garantir o controle visual ao quebrar a ponta do eletrodo, use um microscópio com um objectivo mínimo de 10x e 10x oculares. A escala de medida inserida no ocular também serão necessários para medir tamanhos de ponta. Anexar um pedaço de plexiglass para o microscópio de modo que a extremidade do plexiglass pode ser visto em cerca de um terço a um meio do campo de visão do microscópio. No nosso caso, a peça de plexiglass é cerca de 25 x 70 mm e 5 mm de espessura e ligada por meio de um parafuso que pode ser fixada em um personalizadofeito fio em platina do microscópio. É importante ter um design que permite que o plexiglass mover independentemente da corrediça. Coloque o eletrodo multibarrel em uma cama de massa de modelar sobre uma lâmina de vidro, e inserir o slide contendo o eletrodo no suporte do microscópio do slide. Usando manipuladores do microscópio de xy, mova suavemente a ponta do eletrodo contra a peça de acrílico, e observar a quebra da ponta através das oculares do microscópio. Tentativa de limpa quebrar a ponta multibarrel para um diâmetro acumulado de cerca de 25-35 micrômetros. Descarte pipetas com diâmetros de ponta que se desprenderam muito grande, ou dicas com intervalos irregulares. Nós descartar aproximadamente 30% dos eléctrodos devido às nossas multibarrel pontas de formas indesejáveis. Montar Piggy back-eletrodo Montar piggy-back eletrodo. Eléctrodos de posição. Remover pedaço plexiglass usado no passo 2.2 a partir de platina do microscópio. Fixe concluídamultibarrel eletrodo em massa de modelar sobre uma lâmina de vidro, a ponta apontando ligeiramente para cima. Apontando para cima, será importante para o passo 3.2, a colagem dos dois eléctrodos. Dicas que apontam-se fazer com que a cola para fugir da ponta, evitando a colagem das pontas dos eletrodos. Insira dobrado eléctrodo único barril em suporte de eléctrodo do micromanipulador feitos (Figura 2). Usando orientação visual em primeiro lugar e então a orientação de microscópica, abaixe o eletrodo único barril para o eletrodo multibarrel. O único eléctrodo deve ser reduzido directamente para dentro da ranhura que é formada pela disposição das 5 barris, com a sua ponta a ponta saliente da ponta multibarrel por cerca de 5-10 micrómetros. Ao abaixar o tambor único, observar de perto o ângulo que é formado entre os dois eléctrodos. Para obter o melhor resultado evitar quaisquer ângulos em que as pontas apontam afastados uns dos outros, mas sim tentar diminuir o único eléctrodo para o multi perfeitamente paralelos, ou mesmo com a sua pontatocando o multibarrel primeira, formando um arranjo muito ligeiro "cunha". Uma vez que a ponta do tambor só é muito flexível, que se curva quando o único eléctrodo é abaixado um pouco mais após a ponta ter atingido a superfície de topo do eléctrodo de barril múltiplas, formando uma ponta limpa composto que tem uma quantidade pequena de acção de mola embutido que ajuda a manter as pontas juntas. No entanto, se o ângulo entre o tambor e único eléctrodo multibarrel é demasiado íngreme (muito de uma cunha), a acção de mola vai ser muito alta e dobrar para baixo o arranjo de eléctrodo. Eixos cola eletrodos juntos. Cole as hastes dos dois eletrodos em conjunto usando cianoacrilato (super cola). Coloque uma pequena gota de cola para o lado pequeno de um palito plano e conjunto de eléctrodos de contato com a gota de cola. Comece na posição mais distal das dicas e mova lentamente palito com queda de cola ao longo eixos de eletrodos para as pontas dos eletrodos. Usando cola demais, ou a aplicação de cola too perto das pontas de eléctrodos irá resultar na colagem das aberturas dos eléctrodos, tornando o eléctrodo pelo menos parcialmente funcional. Estabilizar conjunto com cimento dental. Misture uma pequena quantidade de cimento dentário e acrílico dental em um prato de plástico descartável pequeno barco ou pesar, utilizando um palito plana. Espere até que o cimento se torna moldável e se aplica uma pequena quantidade para a junção entre os dois eléctrodos para estabilizar a articulação (material-de-rosa na Figura 3). Permitir que cerca de 15 minutos para secar. Retire e guarde eletrodo. Retire cuidadosamente o eletrodo concluída piggy-back a partir do primeiro titular micromanipulador, e depois separar da lâmina de vidro, e guarde em um recipiente à prova de poeira. Preparar soluções Eletrodo de preenchimento Preparar soluções eléctrodo de enchimento. Uma vez que a iontoforese requer moléculas carregadas, a maioria dos agentes têm de ser dissolvidos ou em um meio ácido ou alcalino (tipicamente umta pH de cerca de 3-4, ou um pH de cerca de 8-10, respectivamente). Um certo número de produtos químicos que são usados ​​frequentemente em iontoforese são listados na Tabela 1. No caso dos agentes que não estão listados na tabela, determinar a partir do valor de pKa, se seria mais fácil de utilizar a molécula de ácido ou em um ambiente alcalino para manter a molécula carregada, e dissolvem-se em conformidade. Para melhores resultados, misture todas as soluções diariamente. Preencha e Preparar Eletrodos Preencher e preparar eletrodos. Pouco antes, usando o eletrodo, de volta a encher cada barril com seu respectivo medicamento, usando fibra de carbono 28-34 agulhas de calibre ligados a seringas com filtros de seringa. Encha as quatro barris exteriores da configuração 5-barril com os fármacos de eleição, e o centro do tambor com NaCl 3M como um tambor de equilíbrio. Preencha o eletrodo de registro único barril com NaCl 3M também. Adicionando um corante para a solução de NaCl, tal como o vermelho ou verde fenol rápido irá tornar mais fácil visualizar a ponta do eléctrododurante a colocação do eléctrodo sobre a superfície do cérebro. Insira o eletrodo no porta-eletrodo da configuração de gravação e inserir todos os fios para os barris de vidro apropriados. Use fio isolado de prata a partir da qual cerca de 1 cm de isolamento foi removida na ponta. Não deve ser de 5 fios para o eléctrodo multibarrel (4 barris de drogas e um tambor de equilíbrio), mais o fio amplificador que necessita de ser inserido no eléctrodo barril de gravação única. Ligue módulos de bomba Iontoforese Ligue módulos de bomba de iontoforese e testar todos os barris. A função de teste de eletrodo de cada módulo da bomba irá ajudar a determinar se o barril do eletrodo é funcional. Para prevenir fugas da droga a partir dos tambores quando não está em uso, uma tensão de retenção na polaridade oposta à carga molécula tem de ser aplicada.