Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em> Drosophila</em
Summary
Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in<em> Drosophila</em> Durante l'infezione batterica, nonché la capacità di mosche di montare una risposta immunitaria per la sopravvivenza di controllo, carica batterica, e in tempo reale delle attività di un regolatore chiave dell'immunità innata, NFκB.
Abstract
Una complessa interazione tra la risposta immunitaria e comportamento host è stato descritto in una vasta gamma di specie. Sonno eccesso, in particolare, si verifica come risposta a infezione nei mammiferi e 1 è stata recentemente descritta in Drosophila melanogaster 2. E 'generalmente accettato che il sonno è vantaggioso per l'host durante un'infezione e che è importante per il mantenimento di un robusto sistema immunitario 3,4. Tuttavia, prove sperimentali che supporta questa ipotesi è limitata 4, e la funzione del sonno eccesso durante una risposta immunitaria è chiaro. Abbiamo usato un approccio multidisciplinare per affrontare questo problema complesso, e hanno condotto studi nel sistema semplice modello genetico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Usiamo un test standard per misurare il comportamento locomotorio e dormire in mosche, e dimostrare come questo test viene utilizzato per misurare il comportamento di mosche infected con un ceppo di batteri patogeni. Questo saggio è utile anche per monitorare la durata della sopravvivenza in mosche singoli durante un'infezione. Ulteriori misure della funzione immunitaria includono la capacità di mosche per cancellare una infezione e l'attivazione di NFκB, un fattore di trascrizione chiave che è fondamentale per la risposta immunitaria innata in Drosophila. Sia esito di sopravvivenza e la clearance batterica durante l'infezione insieme sono indicatori di resistenza e tolleranza alle infezioni. Resistenza si riferisce alla capacità di mosche per cancellare un'infezione, mentre la tolleranza viene definita come la capacità di accoglienza per limitare i danni di un'infezione e quindi sopravvivere nonostante alti livelli di patogeni all'interno del sistema 5. Monitoraggio in tempo reale delle attività in corso di infezione NFκB permette di comprendere un meccanismo molecolare di sopravvivenza durante l'infezione. L'uso di Drosophila in questi saggi semplici facilita le analisi genetiche e molecolari di sonnoe la risposta immunitaria e come questi due sistemi complessi sono reciprocamente influenzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo delinea un approccio per studiare come comportamento, particolarmente dormire, è connesso a parametri di risposta immunitaria. Questi parametri includono la carica batterica, esito di sopravvivenza, e l'attività NFκB come misurato da un reporter luciferasi in vivo. Insieme essi danno informazioni su quanto bene una mosca in grado di combattere l'infezione. Carica batterica e dei risultati di sopravvivenza sono parametri di risposta immunitaria che comportano una misura semplice in <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation in concessione # IOS-1025627 e dal National Institutes of Health in concessione # 1R21NS078582-01 a JAW
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
Riferimenti
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