Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em> Drosophila</em
Summary
Um eine Verbindung zwischen der Immunantwort und Verhalten zu verstehen, beschreiben wir eine Methode, um Bewegungs-Verhalten zu messen<em> Drosophila</em> Während bakterielle Infektion als auch die Fähigkeit der Fliegen, um eine Immunantwort durch Überwachung Überleben, bakterielle Belastung und Echtzeit-Aktivität eines zentraler Regulator der angeborenen Immunität, NFKB montieren.
Abstract
Eine komplexe Wechselwirkung zwischen der Immunantwort und Host Verhalten wurde in einer Vielzahl von Arten beschrieben worden. Überschüssiges Schlaf, insbesondere, ist bekannt, als Reaktion auf eine Infektion in Säugern 1 auftreten und kürzlich auch in Drosophila melanogaster 2 beschrieben. Es ist allgemein anerkannt, daß der Schlaf nützlich zum Host während einer Infektion ist, und dass es für die Beibehaltung einer robusten Immunsystems 3,4 wichtig. Jedoch gibt experimentelle Hinweise, dass diese Hypothese unterstützt begrenzte 4, und die Funktion des Schlafes Überschuß bei einer Immunantwort bleibt unklar. Wir haben einen multidisziplinären Ansatz verwendet, um dieses komplexe Problem anzugehen, und habe durchgeführten Studien in der einfachen genetischen Modellsystem der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Wir verwenden eine Standard-Test zur Messung lokomotorische Verhalten und schlafen in Fliegen, und zeigen, wie dieser Test verwendet wird, um das Verhalten der Fliegen infecte messend mit einem pathogenen Stamm von Bakterien. Dieser Assay ist auch nützlich zur Überwachung der Dauer des Überlebens in einzelnen Fliegen während einer Infektion. Zusätzliche Maßnahmen der Immunfunktion umfassen die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion und die Aktivierung von NFkB, ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der von zentraler Bedeutung für die angeborene Immunantwort in Drosophila ist klar. Sowohl das Überleben Ergebnis und bakterielle Clearance während der Infektion zusammen sind Indikatoren für Widerstand und Toleranz gegenüber Infektionen. Widerstand bezieht sich auf die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion zu löschen, während Toleranz als die Fähigkeit des Wirts, um eine Beschädigung von einer Infektion zu begrenzen und dadurch trotz hoher Pathogen innerhalb des Systems 5 überleben definiert ist. Echtzeit-Überwachung von NFKB Aktivität während der Infektion gibt einen Einblick in einen molekularen Mechanismus des Überlebens während der Infektion. Die Verwendung von Drosophila in diesen einfachen Tests erleichtert die genetische und molekulare Analysen des Schlafesund die Immunantwort und wie diese beiden komplexen Systemen wechselseitig beeinflusst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zu untersuchen, wie Verhalten, insbesondere schlafen, um die Immunantwort Parametern verknüpft. Zu diesen Parametern gehören bakterielle Belastung, Überleben Ergebnis und NFkB-Aktivität, wie durch eine Luciferase-Reporter in vivo gemessen. Zusammen stellen diese Parameter liefern Informationen darüber, wie gut eine Fliege kann eine Infektion zu bekämpfen. Bakterielle Belastung und Überleben Ergebnis sind Immunantwort Parameter, die eine einfache Messung in Dro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unter dem Förderkennzeichen # IOS-1025627 unterstützt und von den National Institutes of Health unter dem Förderkennzeichen # 1R21NS078582-01 bis JAW
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
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