Determinación de la acidez en fase gaseosa de oligopéptidos

Los acidez de los residuos de aminoácidos están entre las propiedades más importantes termoquímicos que influyen en las estructuras, la reactividad, y los procesos de plegado de las proteínas que se desarrollan ^9,19. Residuos de aminoácidos individuales a menudo muestran diferentes acideces eficaces en función de sus ubicaciones en las proteínas. En particular, los residuos localizados en los sitios activos exhiben a menudo perturbados significativamente acidez. Un ejemplo de ello es el residuo de cisteína que residen en los sitios activos de la tiorredoxina super-familia de enzimas ^20,21. La cisteína del sitio activo es inusualmente ácida en comparación con los de las proteínas desplegadas ^3-5. Se ha sugerido que la conformación helicoidal puede tener una importante contribución a la acidez inusual. Hay amplios estudios experimentales sobre las propiedades ácido-base de los péptidos realizadas en soluciones, sobre todo en soluciones acuosas ^2,6-8. Los resultados a menudo se complica por los efectos del solvente^7. De hecho, la mayoría de los sitios activos en las proteínas se encuentran cerca de la región interior, donde los efectos del disolvente se reducen al mínimo ^9,10.

A fin de comprender las propiedades ácido-base intrínsecas de péptidos y proteínas, es importante para llevar a cabo los estudios en un entorno libre de disolvente. Aquí presentamos un método de espectrometría de masas basado en la determinación de la acidez de la fase de gas. Se conoce como el método de cinética cocineros extendida El enfoque. Este método se ha aplicado con éxito a una amplia gama de sistemas químicos para la determinación de diversas propiedades termoquímicas, tales como la acidez en fase gaseosa, la afinidad protónica, la afinidad con un ion de metal, la afinidad electrónica, y la energía de ionización ^{11-15, 22-26.} Hemos aplicado este método para determinar la acidez de fase de gas de una serie de oligo-polialanina cisteína y cisteína-poliglicina péptidos ^17,18,27. Estos estudios muestran que la cisteína N-terminal de PeptidES son significativamente más ácidos que los correspondientes C-terminales. Es probable que los altos acidez de la ex se deben a los efectos conformacionales helicoidales en el que el anión tiolato está fuertemente estabilizado por la interacción con la hélice macro-dipolo. Debido a la naturaleza no volátil y térmicamente lábiles de los péptidos, el método de cinética es el enfoque más práctico disponible en la actualidad para producir ácido-base termoquímicos cantidades razonablemente precisos de péptidos ^28.

El esquema general y la ecuación asociada con el método de cinética se muestran en la Figura 1. La determinación de la acidez en fase gaseosa de un péptido (AH) comienza con la formación de una serie de aniones de racimo de protones enlazados, [A • H • Un _i] ¯ (o [A ¯ • H ⁺ • Un _i ¯] ¯), en la región de la fuente de iones del espectrómetro de masas, donde A y A _i ¯ ¯ son las formas desprotonados del péptido ylos ácidos de referencia, respectivamente. Los ácidos de referencia son compuestos orgánicos con conocidos acidez de fase de gas. Los ácidos de referencia deben tener estructuras similares entre sí (pero no necesariamente similar a la del péptido). La similitud de las estructuras entre ácidos de referencia asegura la similitud de las entropías de desprotonación entre ellos. El cluster de protones enlazado aniones se seleccionan de masa y colisional activados y posteriormente disociarse utilizando experimentos de disociación inducida por colisión (CID) para producir los correspondientes aniones monoméricos, Un ¯ y A _i ¯, con constantes de velocidad de k y k _i, respectivamente, se muestra en la Figura 1a. Si fragmentaciones secundarios son insignificantes, la razón de abundancia de los iones de fragmentos CID, [A ¯] / [A _i ¯], representa una medida aproximada de la relación de las constantes de velocidad, k / k _i. Bajo el supuesto de que no hay marcha atrás activatbarreras de iones para ambos canales de disociación, el ión producto CID relaciones de ramificación, ln [A ·] / [A _i ¯], se linealmente correlacionados con la acidez de la fase gaseosa del péptido (Δ _ácido H) y las de los ácidos de referencia (Δ _ácido H _i), como se muestra en la Figura 1b. En esta ecuación, _ácido Δ H _promedio es la acidez media en fase gaseosa de los ácidos de referencia, Δ (Δ S) es el término de entropía (que puede ser asumido constante si los ácidos de referencia son estructuralmente similares entre sí), R es la constante universal de los gases, y T _ef es la temperatura efectiva del sistema. La temperatura efectiva es un parámetro empírico que depende de varias variables experimentales, incluyendo la energía de colisión.

El valor de la acidez de la fase de gas se determina mediante la construcción de dos conjuntos de parcelas termo-cinéticas. El primer conjunto es obcontenida por el trazado de ln ([A ¯] / [A _i ¯]) contra _ácido Δ H _i – _ácido Δ H _promedio, como se muestra en la Figura 4a. La regresión lineal dará lugar a un conjunto de líneas rectas con las pistas de X = 1 / RT _ef e intercepta de Y = – _[ácido Δ H – Δ _{ácido promedio} H] / RT _ef – Δ (Δ S) / R. El segundo conjunto de parcelas se obtiene mediante el trazado de las intersecciones resultantes (Y) desde el primer conjunto contra las pistas correspondientes (X), como se muestra en la Figura 4b. Regresión lineal produce una nueva línea con una pendiente de _ácido Δ H – Δ H _{ácido promedio} y una intercepción de Δ (Δ S) / R. El valor Δ de _ácido H se obtiene entonces a partir de la pendiente y el término entropía, Δ (Δ S), se obtiene a partirla intersección.

Los experimentos se realizaron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo interfaz con una ionización por electrospray (ESI) fuente de iones. Un diagrama esquemático del espectrómetro de masas se muestra en la Figura 2. Los experimentos CID se llevan a cabo en masa seleccionar los aniones de racimo de protones enlazados con la primera unidad de cuadrupolo y permitiendo a someterse a colisiones con átomos de argón filtrados en la cámara de colisión que se mantiene a una presión de alrededor de 0,5 mTorr. Los iones de productos de disociación se analizaron en masa con la tercera unidad de cuadrupolo. Los espectros CID se registran a varias energías de colisión con la gama de m / z suficientemente amplia para cubrir todos los posibles fragmentos secundarios. Los CID intensidades de iones de productos se miden configurando el instrumento en el control de la reacción seleccionada (SRM) en el que el modo de exploración se centra en iones de productos seleccionados. Los experimentos CID se realizan en cuatro energías de colisión diferentes, correspondientes aenergías centro de masa (E _cm) de 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 eV, respectivamente. La energía del centro-de-masa se ​​calcula utilizando la ecuación: E = E _{laboratorio cm} [m / (M + m)], donde E es _{laboratorio de} la energía de colisión en el marco del laboratorio, m es la masa de argón, y M es la masa del ion clúster de protones enlazado.

En este artículo, utilizamos el oligopéptido Ala ₃ CysNH ₂ (A ₃ CH) como compuesto modelo. El extremo C-terminal está amidado y el grupo tiol (SH) del resto de cisteína será el sitio ácido. La selección de los ácidos de referencia adecuados es crucial para el éxito de la medición de la acidez de la fase de gas. Los ácidos de referencia ideales son estructuralmente similares (entre sí) compuestos orgánicos con valores de acidez en fase gaseosa bien establecidos. Los ácidos de referencia deben tener valores de acidez cercanas a la de los péptidos. Para el péptido A ₃ CH, seis halogenado carboxılicoc ácidos son elegidos como los ácidos de referencia. Los ácidos de referencia seis son el ácido cloroacético (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido difluoroacético (DFAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacético (DBAH) y trifluoroacético (TFAH). Dos de ellos, DFAH y MBAH, servirán para ilustrar el protocolo.