Determinação da acidez em fase gasosa de Oligopeptídeos

A acidez de resíduos de aminoácidos estão entre as mais importantes propriedades termoquímicos que influenciam as estruturas, a reactividade, e os processos de dobragem de proteínas que se ^{desdobram-9,19.} Resíduos de aminoácidos individuais mostram muitas vezes diferentes acidez eficazes dependendo de suas localizações em proteínas. Em particular, os resíduos localizados nos locais activos exibem frequentemente perturbado significativamente a acidez. Um exemplo é o resíduo de cisteína residentes nos sítios ativos do thioredoxin super-família de enzimas ^20,21. A cisteína sítio ativo é extraordinariamente ácidos em relação aos de proteínas desdobradas ^3-5. Tem sido sugerido que a conformação helicoidal pode ter uma contribuição significativa para a acidez incomum. Existem amplos estudos experimentais sobre as propriedades do ácido-base de péptidos realizadas em soluções, especialmente em soluções aquosas ^2,6-8. Os resultados foram muitas vezes complicada por efeitos do solvente^7. Na verdade, a maioria dos sítios ativos das proteínas estão localizadas perto da região do interior, onde os efeitos de solventes são minimizados ^9,10.

A fim de compreender as propriedades dos péptidos e proteínas intrínsecas ácido-base, é importante para a realização dos estudos em um ambiente livre de solvente. Apresentamos aqui um método baseado em espectrometria de massa para a determinação da acidez em fase gasosa. A abordagem é referido como o método cinético prolongado cozinheiros. Este método tem sido aplicado com sucesso a uma grande gama de sistemas químicos para a determinação de diversas propriedades termodinâmicas, tais como a acidez da fase gasosa, a afinidade do protão, a afinidade de ião de metal, a afinidade de electrões, e a energia de ionização ^{11-15, 22-26.} Aplicou-se este método para determinar a acidez em fase gasosa de uma série de oligossacáridos de cisteína-cisteína e polialanina poliglicina péptidos ^17,18,27. Esses estudos mostram que a cisteína N-terminal peptídeoes são significativamente mais ácida do que os correspondentes de C-terminal. As altas acidez da primeira são provavelmente devido aos efeitos conformacionais helicoidais em que o anião tiolato é fortemente estabilizados pela interacção com a hélice a macro-dipolo. Devido à natureza não-voláteis e termicamente lábil de péptidos, o método de cinética é a abordagem mais prática actualmente disponíveis para produzir o ácido-base termoquímica quantidades razoavelmente precisos de péptidos ^28.

O esquema geral e a equação associado com o método cinético são mostrados na Figura 1. A determinação da acidez em fase gasosa de um péptido (AH) começa com a formação de uma série de aniões de fragmentação de protões ligados, [A • • H A _i] ¯ (ou [A ¯ • • H ⁺ A _i ¯] ¯), na região da fonte de iões do espectrómetro de massa, em que A e A ¯ _i ¯ desprotonados são as formas do péptido eos ácidos de referência, respectivamente. Os ácidos orgânicos são os compostos de referência conhecidos, com a acidez da fase de gás. Os ácidos de referência deve ter estruturas semelhantes uns aos outros (mas não necessariamente idêntico ao do péptido). A semelhança de estruturas entre os ácidos de referência assegura a semelhança das entropias de desprotonação entre eles. O aglomerado próton-bound aniões são seleccionados de massa e collisionally activado e subsequentemente dissociado utilizando dissociação induzida por colisão (CID) experiências para produzir os correspondentes aniões monoméricos, A e A ¯ _i ¯, com constantes de taxa de K e K _i, respectivamente, mostrados na Figura 1A. Se fragmentações secundárias são negligenciáveis, a taxa de abundância dos iões de fragmentos CID, [A ¯] / [A _i ¯], representa uma medida aproximada do rácio das constantes de velocidade, k / k _i. Sob a hipótese de que não há activat reversabarreiras de iões para a dissociação de ambos os canais, o ião do produto de CID ramificação rácios, ln [A °] / [A _i ¯], será linearmente correlacionada com a acidez da fase gasosa do péptido (Δ _ácido H) e os dos ácidos de referência (Δ _{ácido i} H), como mostrado na Figura 1b. Nesta equação, Δ _ácido H _médio é a acidez média de fase gasosa dos ácidos de referência, Δ (Δ S) é o termo de entropia (que pode ser assumida constante se os ácidos de referência são estruturalmente semelhantes uns aos outros), R é o constante universal dos gases e T é a temperatura _ef eficaz do sistema. A temperatura efectiva é um parâmetro empírico que depende de diversas variáveis ​​experimentais, incluindo a energia de colisão.

O valor da acidez da fase gasosa é determinado pela construção de dois conjuntos de gráficos de termo-cinéticos. O primeiro conjunto é obretidos pela traçando ln ([A ¯] / [A _i ¯]) contra Δ _ácido H _i – Δ _ácido H _médio, como mostrado na Figura 4a. Regressão linear trará um conjunto de linhas retas com as encostas de X = 1 / RT _FEP e interceptações de Y = – [Δ _ácido H – Δ _ácido H _médio] / RT _FEP – Δ (Δ S) / R. O segundo conjunto de parcelas é obtido através da representação gráfica dos intercepta resultantes (Y) a partir do primeiro conjunto de encontro às inclinações correspondentes (X), conforme mostrado na Figura 4b. A regressão linear produz uma nova linha com um declive de Δ _ácido H – Δ _ácido H _médio e uma intercepção de Δ (Δ S) / R. O valor de _ácido Δ H é então obtido a partir do declive e o termo entropia, Δ (Δ S) é obtido a partir dea interceptação.

Os experimentos são realizados usando um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo, interligados a uma ionização por electrospray (ESI), fonte de iões. Um diagrama esquemático do espectrómetro de massa é mostrado na Figura 2. As experiências são realizadas por CID massa escolhendo os aniões de fragmentação de protões ligados com a primeira unidade de quadrupolo e permitindo que eles sofrem colisões com átomos de árgon vazados para a câmara de colisão, que é realizada a uma pressão de cerca de 0,5 mTorr. Os iões dos produtos de dissociação são analisados ​​em massa com a terceira unidade de quadrupolo. Os espectros de CID são registrados em várias energias de colisão com a faixa de m / z grande o suficiente para cobrir todas as possíveis fragmentos secundários. As intensidades de iões produtos CID são medidos, definindo o instrumento no modo de monitorização de reacção seleccionada (SRM) no qual a verificação é focada em iões dos produtos seleccionados. Os experimentos são realizados CID em quatro diferentes energias de colisão, o que corresponde aenergias de centro de massa (E _cm) de 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 eV, respectivamente. A energia de centro de massa é calculado utilizando a fórmula: E = E _{cm laboratório} [M / (M + m)], onde E é a energia _{de laboratório} colisão no quadro de laboratório, m é a massa de árgon, e M é a massa do ião de cluster protão ligado.

Neste artigo, usamos o oligopéptido Ala ₃ CysNH ₂ (CH ₃₎ como composto modelo. O C-terminal está amidado e o grupo tiol (SH), do resíduo de cisteína será o local ácido. A selecção dos ácidos de referência adequado é crucial para o sucesso da medida da acidez em fase gasosa. Os ácidos de referência ideais são estruturalmente semelhantes (entre si) compostos orgânicos com valores de acidez em fase gasosa bem estabelecidas. Os ácidos de referência deve ter valores de acidez mais próximos daquele dos péptidos. Para o péptido A ₃ CH, seis halogenados carboxylic ácidos são escolhidos como os ácidos de referência. Os seis ácidos de referência são o ácido cloroacético (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido difluoroacético (DFAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacetic (DBAH) e trifluoroacico (TFAH). Dois deles, DFAH e MBAH, irá ser usado para ilustrar o protocolo.