קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides
Summary
קביעת acidities גז השלב של oligopeptides המכיל ציסטאין מתוארת. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש. את acidities היחסי של פפטידים נמדדים באמצעות ניסויי דיסוציאציה התנגשות-Induced, ואת acidities כמותיות נקבעות באמצעות טבחים ממושכים שיטה קינטית.
Abstract
שאריות חומצת אמינו הנמצאים בתפקידים שונים בחלבונים מקופלים מפגינות לעתים קרובות דרגות acidities שונות. לדוגמה, שאריות ציסטאין ממוקמים ליד או N-סופית של סליל היא לעתים קרובות יותר חומצי מזה ליד או C-הסופית 1-6. למרות שמחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים בוצעו בשלב המרוכז, במיוחד בתמיסות מימיות 6-8, התוצאות לעתים קרובות מסובכות על ידי השפעות ממס 7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס כבר ממוזערים 9,10. על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע המחקרים בסביבה נטולת ממס.
אנו מציגים שיטה למדידת acidities של oligopeptides בגז השלב. אנו משתמשים המכיל ציסטאין Oligopeptide, עלא 3 CysNH <sUB> 2 (CH 3), כמודל למתחם. המדידות מתבססות על השיטה המבוססת היטב המורחבת טבחים הקינטית (איור 1) 11-16. הניסויים מתבצעים באמצעות ספקטרומטר מסה משולש quadrupole ממשק עם יינון electrospray (ESI) מקור יון (איור 2). עבור כל דגימת פפטיד, חומצות התייחסות למספר נבחרו. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם acidities גז שלב ידוע. פתרון של התערובת של הפפטיד וחומצת התייחסות מוחדר ספקטרומטר המסה, ומקבץ anionic גז שלב פרוטון בכריכה של חומצת פפטיד הפניה הוא נוצר. אשכול פרוטון בכריכה מבודד המוני ומקוטע בהמשך דרך התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים. את שכיחות יון שבר כתוצאה מכך הם נותחו באמצעות מערכת יחסים בין acidities וקינטיקה דיסוציאציה יון האשכול. חומציות גז השלב של הפפטיד היא אז obtaiנד על ידי רגרסיה לינארית של החלקות תרמו הקינטית 17,18.
השיטה ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מולקולריות, כולל תרכובות אורגניות, חומצות אמינו ונגזרותיהם, oligonucleotides וoligopeptides. על ידי השוואת acidities גז השלב נמדד בניסוי עם אותם הערכים שחושבו עבור conformers שונה, ניתן להעריך השפעות קונפורמציה על acidities.
Introduction
את acidities של שאריות חומצת אמינו הוא בין המאפיינים החשובים ביותר המשפיעים על thermochemical מבנים, תגובתיות, והתהליכים שהתרחש קיפול של חלבונים 9,19. שאריות חומצת אמינו בודדות לעתים קרובות להראות acidities היעיל שונה בהתאם למיקומם בחלבונים. בפרט, את השאריות הנמצאות באתרים הפעילים מפגינות לעתים קרובות מוטרד acidities באופן משמעותי. דוגמה אחת כזו היא שאריות ציסטאין המתגוררים באתרים הפעילים של סופר המשפחה של אנזימי thioredoxin 20,21. ציסטאין האתר הפעיל הוא חומצי במיוחד בהשוואה לאלו בפרשו חלבונים 3-5. היה מי שהציע שקונפורמציה הסליל יכולה להיות תרומה משמעותית לחומציות יוצאת דופן. ישנם מחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים שבוצעו בפתרונות, בעיקר בתמיסות מימיות 2,6-8. התוצאות לעתים קרובות היו מסובכות על ידי אפקטי ממס7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס הם מזעריים 9,10.
על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע את המחקרים בסביבה נטולת ממס. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על ספקטרומטריית מסה לקביעת חומציות גז השלב. הגישה שמכונה שיטה הקינטית המורחבת טבחים. שיטה זו יושמה בהצלחה במגוון רחב של מערכות כימיות לזיהוי תכונות thermochemical שונים, כגון חומציות גז השלב, זיקת הפרוטון, זיקת יון המתכת, זיקה האלקטרונית, ואנרגיה יינון 11-15, 22-26. יש לנו ליישם שיטה זו על מנת לקבוע את acidities גז השלב של סדרה של אוליגו ציסטאין-polyalanine וציסטאין-polyglycine פפטידים 17,18,27. מחקרים אלה מראים כי ציסטאין N-מסוף peptidES באופן משמעותי יותר חומצי מאלה C-המסוף המתאימים. את acidities הגבוהות של לשעבר צפוי בשל השפעות קונפורמציה הסליל שבי אניון thiolate הוא התייצב בחום על ידי האינטראקציה עם מקרו דיפול סליל. בגלל האופי בלתי נדיף ותרמית יציב של פפטידים, השיטה הקינטית היא הגישה המעשית ביותר שקיים כיום כדי לייצר כמויות thermochemical מדויקות למדי חומצת בסיס של פפטידים 28.
התכנית הכללית והמשוואה קשורה לשיטה הקינטית מוצגות באיור 1. קביעת חומציות גז השלב של הפפטיד (AH) מתחילה עם הקמתה של סדרה של אניוני מצרר פרוטון בכריכות, [• H • i] ¯ (או [¯ • + H • אני ¯] ¯), באזור מקור יון של ספקטרומטר המסה, שבו ¯ ואני ¯ הם צורות deprotonated של הפפטיד וחומצות התייחסות, בהתאמה. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות עם acidities גז שלב ידוע. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה (אך לא בהכרח דומה לזה של פפטיד). הדמיון של המבנים בין חומצות התייחסות מבטיח דמיון של entropies של deprotonation ביניהם. אשכול פרוטון בכריכה האניונים נבחרו המוניים והופעל collisionally ולאחר מכן ניתק באמצעות התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים כדי להניב את אניוני monomeric המקביל, ¯ ואני ¯, עם קבועי קצב של K ו-K אני, בהתאמה, מוצג באיור 1 א. אם פיצולים משניים הם זניחים, יחס השפע של יוני בר CID, [¯] / [i ¯], מייצג מידה משוערת של היחס של קבועי קצב, K / K i. בהנחה שאין activat ההפוךמחסומי יונים בשני ערוצי דיסוציאציה, יון מוצר CID הסתעפות יחסים, בפיו [א ¯] / [A i ¯] חומצות התייחסות, יהיה מתואם ליניארי לחומציות גז השלב של הפפטיד (Δ החומצה H) ואלה של (Δ חומצת ח ט), כפי שמוצג באיור 1. במשוואה זו, Δ חומצת H ממוצע היא חומציות גז השלב הממוצעת של חומצות התייחסות, Δ (Δ S) הוא מונח האנטרופיה (שניתן להניח מתמיד אם חומצות התייחסות הן מבחינה מבנית דומות זה לזה), R הוא קבוע גז אוניברסלי, ו-T EFF הוא הטמפרטורה היעילה של המערכת. הטמפרטורה היעילה היא פרמטר אמפירי שתלוי במספר משתנים ניסיוניים, כולל את האנרגיה ההתנגשות.
הערך של חומציות גז השלב נקבע על ידי בניית שני סטים של חלקות תרמו הקינטית. הסט הראשון הוא obמזרקה על ידי התוויית LN ([¯] / [i ¯]) נגד Δ חומצת H i – Δ חומצת H ממוצע, כפי שמוצגת באיור 4 א. רגרסיה לינארית תניב קבוצה של קווים ישרים עם המדרונות של X = 1 / RT EFF ומיירט של Y = – [Δ H החומצה – חומצת Δ H AVG] / RT EFF – Δ (Δ S) / R. הסט השני של חלקות מתקבל על ידי מתכנן את תוצאת מיירט (Y) מהקבוצה הראשונה נגד המדרונות המתאימים (X), כפי שמוצגת באיור 4. רגרסיה לינארית מייצרת קו חדש עם שיפוע של Δ H החומצה – חומצת Δ H AVG ויירוט של Δ (Δ S) / R. הערך של Δ החומצה H לאחר מכן התקבל מהמדרון ומונח אנטרופיה, Δ (Δ S), מתקבלהיירוט.
הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש ממשק ליינון electrospray (ESI) מקור יון. תרשים סכמטי של ספקטרומטר המסה מוצג באיור 2. ניסויי CID מבוצעים על ידי מסת בחירת אניוני מצרר פרוטונים הכרוכים עם יחידת quadrupole הראשונה ומאפשרת להם לעבור התנגשויות עם אטומי ארגון דלפו לתוך תא ההתנגשות המתקיים בלחץ של סביב 0.5 mTorr. את יוני מוצר דיסוציאציה מנותחים המוניים עם יחידת quadrupole השלישית. ספקטרום CID נרשם בכמה אנרגיות התנגשות עם מגוון מ '/ z הרחב מספיק כדי לכסות את כל שברים משניים האפשריים. עוצמות יון מוצר CID נמדדות על ידי הגדרת המכשיר בניטור התגובה הנבחרת (SRM) במצב שבו הסריקה מתמקדת ביוני מוצר נבחרים. ניסויי CID מבוצעים בארבע אנרגיות התנגשות שונות, המקביל לאנרגיות מרכז מסה של-E (ס"מ) של 1.0, 1.5, 2.0, ו -2.5 EV, בהתאמה. מרכז האנרגיה של המסה מחושבת באמצעות המשוואה: E = E ס"מ המעבדה [מ '/ (M + מ')], שבו דואר מעבדה היא האנרגיה ההתנגשות במסגרת המעבדה, מ 'הוא המסה של ארגון, ו-M הוא המסה של פרוטון יון האשכול בכריכה.
במאמר זה, אנו משתמשים עלא Oligopeptide 3 CysNH 2 (CH 3) כמתחם המודל. C-הסופית הוא amidated וקבוצת תיאול (SH) של שאריות ציסטאין תהיה חומצי באתר. הבחירה של חומצות התייחסות המתאימות היא קריטית למדידת ההצלחה של חומציות גז השלב. חומצות התייחסות האידיאליות הן דומות מבחינה מבנית (זה לזה) תרכובות אורגניות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות ערכי חומציות קרובים לזו של פפטידים. לפפטיד CH 3, שש הלוגניים carboxyliחומצות C הן נבחרו כחומצות התייחסות. חומצות התייחסות לשש הן חומצת chloroacetic (MCAH), bromoacetic חומצה (MBAH), חומצת difluoroacetic (DFAH), חומצת dichloroacetic (DCAH), חומצת dibromoacetic (DBAH), וtrifluoroacetic (TFAH). שניים מהם, וDFAH MBAH, ישמש כדי להמחיש את הפרוטוקול.
Protocol
Representative Results
Discussion
המדידה המוצלחת של חומציות גז השלב של פפטיד מסתמכת במידה רבה על הבחירה של חומצות התייחסות מתאימות. חומצות התייחסות האידיאליות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה. זה יבטיח אנטרופיה דומה של…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
Riferimenti
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochimica. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
