1. Clonar os genes terapêuticos em Vetor Shuttle HDAD Clone rato Ngn3 e Btc cDNAs no vector pLPBL1 plasmídeo que contém um promotor ubíquo alongamento factor-1 (BOS) e um sinal de poli-A. Após a conclusão, verificar vetores por análise da seqüência e depois subclonar estas cassetes de expressão em pΔ28 transporte HDAD plasmídeo 6. Vectores vaivém Digest HDAD por Pmel para libertar a espinha dorsal do plasmídeo, purificar ADN por fenol / clorofórmio / álcool isoamílico extracção seguida por precipitação com etanol e reconstituir-transfecção grau água. 2. Ajudante dependente de Produção Vector adenoviral HDAD produção vetor envolve várias etapas que precisam ser seguidas cuidadosamente para melhores resultados. 2,1 Transfecção Dois dias antes da transfecção de semente, as células 116 7 em 6 cm de prato para atingir 70-80% confluentes no dia da transfecção. Três horas antes da transfecção, remova o meio e adicionam-se 5 ml de meio de crescimento fresco [MEM suplementado com 10% FBS e 1% de PSG (penicilina, estreptomicina e glutamina), Invitrogen]. Transfectam 116 células com 10 ug de ADN do passo 1.2), utilizando o kit de transfecção de mamíferos ProFectionR da Promega de acordo com as instruções do fabricante. No dia seguinte, lava-se as células com 1 ml de meio de crescimento 2 vezes. Adicionar helper virus (HV) a 500 partículas de vector (vp) / célula de 0,1 ml de PBS contendo cálcio e magnésio (PBS + +) e de sobreposição para as células. Agite suavemente os pratos para distribuir uniformemente o min cada HV 10. Após 60 min, adicionar 1,5 ml de meio de manutenção (MEM, FBS a 5% PSG, 1%). Adicione outro 1 ml de meio de manutenção no dia seguinte. Observar as células de CPE (efeito citopático – células tornam-se arredondadas e destacado). Maior do que 80% das células devem mostrar CPE 2 dias após a infecção. Colete lisado celular bruto (CVL, células e médio), umdd volume de 10% de sacarose a 40% e armazenar a -80 ° C. A CVL é rotulado como passagem 0 – (CVL-P0). 2,2 amplificação Vector Congelamento (-80 ° C, 3-5 min) / descongelação (37 ° C, 1-2 min) 3 vezes. Sobreposição de 0,5 ml CVL suplementado com HV a 200 vp / célula a confluentes 116 células em 6 cm de prato, e balançar o prato delicadamente min a cada 5. Após 30 minutos, adicionar 1 ml de meio de manutenção. Adicionar 1 ml de manutenção do dia próximo meio. 2 dias mais tarde, a maior parte das células deve mostrar CPE. Recolher o CVL e armazenar a -80 ° C (CVL-P1), tal como descrito para o passo 2.1.8). Repita o procedimento por 3 vezes para obter o CVL P2-P4. Extrair DNA (Blood Dneasy & Tissue Kit, Qiagen) de 0,2 ml de CVL recolhidos em P1-P4, e analisar a amplificação do vector por qPCR utilizando iniciadores HV-e HDAD específico (Tabela 1). Utilizar a passagem na qual HDAD amplificado exponencialmente em relação ao HV (P3 na Figura 2) para a subsequent procedimento. Co-infectam 90% confluentes de células 116 no prato 15 centímetros, com 0,5 ml CVL e HV a 200 vp / célula. Balance o prato delicadamente min a cada 5. Após 30 minutos, adicionam-se 10 ml de meio de manutenção. Adicionam-se 5 ml de meio de manutenção após 24 hr. Recolher as células por centrifugação a 1500 xg durante 5 min exactamente 48 horas após a infecção. Re-suspender as células em 1 ml de PBS + + contendo 4% de sacarose (P5) e congelamento a -80 ° C. 2,3 HDAD produção em grande escala Para preparar 116 células por infecção em cultura de células em suspensão, transferir 116 células confluentes em 8 x prato de 15 cm em três frasco giratório L e adicionar meio de crescimento em suspensão (Joklik modificado MEM suplementado com FBS a 5%, 0,1 mg / ml de higromicina e 1% PSG) para L 1 final, e incubar numa incubadora de CO2, com rotação a 60 rpm 8. Adicionar 0,5 L de meio fresco a cada dia, durante 2 dias (L 2 no total). Contar as células no terceiro dia. Células estão prontas para usar se chegar to número total de células de 1×10 9. Congelamento / descongelamento P5 3 vezes. Recolher as células de balão de 3 L giratório por centrifugação a 1000 xg durante 5 min. Guardar 100 ml de sobrenadante para re-suspender as células. Transferir as células para um balão giratório de 250 ml. Adicionar P5 e HV a 200 vp / célula para as células e incuba-se durante 1 hora a 37 ° C a 60 rpm. Células de transferência e médio no balão 3 L spinner, adicionar 2 L meio de crescimento suspensão. Transferir 1 ml de suspensão de células a um poço numa placa de 12 poços para observar as células para CPE. Incubar as células em balão de agitação, durante 2 dias numa incubadora de CO2 a 60 rpm. Recolher as células por centrifugação e re-suspensão em 15 ml de 100 mM de armazenamento de Tris-HCl (pH 8,0) e à temperatura de -80 ° C (P6) até à purificação. 2,4 purificação Vector Adicionar 1,0 ml de desoxicolato de sódio a 5% para a P6. Misturar suavemente e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Adicionar 400 ul de 2 M de MgCl2, 300 μl de RNase A (10 mg / ml) e 300 ul de DNase I (10 mg / ml) e incubar a 37 ° C durante 1 h. Centrifugar a 6.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente para recolher o sobrenadante. Esterilizar NVT 65 tubos de ultracentrífuga (Beckman) sob luz UV durante 1 hora na capa de cultura de tecidos. Adicionar 2,8 ml de solução de baixa densidade de CsCl (1,25 g / ml), 2,8 ml underlay de alta densidade da solução de densidade de CsCl (1.41g/ml) e, em seguida, 5-6 ml de sobreposição de sobrenadante para encher o tubo com o colo. Utilizar 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), para encher o tubo, se necessário. Centrifugar a 10 ° C durante 30 min a 50.000 rpm a 10 ° C com Beckman LE-80K usando NVT-65 rotor. Limpar a área com etanol a 70% para a punção, e recolher a banda inferior opalescente com uma seringa de 3 ml, equipado com 22-G agulha por punção lateral (Figura 3a). Às vezes, uma banda ajudante muito fraco pode ser visto abaixo da banda de vetor mais proeminente. Tente obter o máximo de the banda de vetor quanto possível, sem a banda ajudante. É aceitável nesta etapa, mesmo que alguns da banda helper é aspirado, uma vez que irá ser separados no subsequente centrifugação durante a noite, que se segue. Coloque as bandas coletados em um novo tubos de ultracentrífuga esterilizados. Encher os tubos para o pescoço através da sobreposição de 1,35 g / ml de solução de densidade de CsCl. Centrifugar a 10 ° C a 50000 rpm durante a noite. Recolher a banda opalescente (Figura 3b). Transfira a banda para uma cassete de diálise (Slide-a-Lyzer, 10.000 MWCO, Thermo-científica). Dializar contra 3 L de 10 mM autoclavado Tis-HCl, pH 7,2, contendo 2 mM de MgCl2 e sacarose a 4%, a 4 ° C durante a noite. Remover a cassete de vector HDAD diálise. Ul alíquota de 20 por titulação física e 50 ul de caracterização do ADN. (Nota: Para Ngn3 vetor, repita "P6" três vezes para obter vetor suficiente uma vez que o rendimento de HDAD-Ngn3 é pobre em comparação com HDAD-BTC ou HDAD vazio.) 2,5 Caracterização dos vectores HDAD Determinar o título físico (vp / ml), usando a densidade óptica (OD). Adicionar 20 ul de vector ou 20 ul de tampão de diálise a 380 ul de tampão TE contendo SDS a 0,1% e incubar a 56 ° C durante 20 min. Medir OD a 260 nm. O título físico OD260 = 1,1 x 10 x 12 x 20 (vp / ml). Analisar a contaminação HV por qPCR. Use alíquota 50 ul de extracto de ADN, utilizando tecido Dneasy / sangue estojo de extracção de ADN (Qiagen). Dilui-se o DNA de 1000 vezes e ter 5 ul para análise qPCR utilizando auxiliar e vector primers específicos (Tabela 1). A contaminação auxiliar deve ser inferior a 1%, como mostrado na Figura 4A. Use de mancha de Southern para analisar a estrutura do vetor. Realizar análise de manchas Southern utilizando uma sonda de 10 para a repetição terminal invertida (ITR). O resultado representativo é mostrado na Figura 4B. Determinar eficácia in vitro. Infect conhecidonúmero de 116 células numa placa de 12 poços com vector HDAD a 1000 vp / célula em quadruplicado. Colheita das células após 48 h e extrair RNA para determinar a expressão de mRNAs Ngn3 e Btc por qRT-PCR (Tabela 1). Os resultados representativos são mostrados na Figura 5. 3. O tratamento de ratos diabéticos por HDAD Ngn3-e-Btc 3,1 A indução de diabetes em ratos e injecção dos vectores HDAD Preparação de STZ: Preparar a 0,1 M de tampão de citrato, e ajustar o pH a 4,3-4,5. Filtrar esta através de um filtro de seringa de 0,22 mm. A utilização de água estéril para diluir este 0,01 M citrato de Na pH 4,2-4,5. Dissolver quantidade apropriada de STZ (Sigma) nesta solução para obter uma concentração final de 12,5 mg / ml. A esta concentração, não há precipitação. Manter esta solução STZ, a 4 ° C até utilizar. Trazer a temperatura da solução de injecção à temperatura ambiente imediatamente antes da injecção. A solução shoul STZd ser preparada a cada dia e injetado dentro de 5-10 minutos de ser dissolvido. Injectar esta solução STZ por via intraperitoneal (10 ul / g para obter uma dose de 125 mg de peso corporal / g), durante a noite entre 5-7 pm (antes das luzes são desligadas na instalação de ratinho e os ratinhos começam a alimentar activamente), em dois dias consecutivos 9. 3,2 Monitorização de glicose ratos e injeção de vetores HDAD. Camundongos rápidos para 6 horas e peso corporal e medida de glicose no sangue semanalmente até ratos têm hiperglicemia (≥ 250mg/dl). Use um glicosímetro One Touch para o sangue coletado por snip cauda. Uma vez que a glicose no sangue é ≥ 250 mg / dl, recheck glucose do sangue novamente em 48 horas depois de um jejum de 6 horas assegurar hiperglicemia persistente e de glicose no sangue está dentro da gama alvo de tratamento: 250-500 mg / dl. Tratar ratos com hiperglicemia persistente por uma única injecção intravenosa de vectores HDAD via veia da cauda. A dose total de vector é 6×10 11 vppara todos os grupos de tratamento (em 0,25 ml): 5×10 11 vp Ngn3 um x10 11 vp BTC para grupo da combinação; 5×10 11 vp Ngn3 + 1×10 11 vp para Ngn3 grupo e 1×10 11 vp Btc + 5×10 11 vetor vp vazio para o grupo e Btc 6×10 11 vetor vp vazio para o grupo controle. Injecção na veia da cauda. Coloque ratos em Tailveiner limitador (TV-150, Braintree Scientific Inc.), e usar água morna para dilatar as veias da cauda, limpar o rabo com álcool a 70%. Segure a cauda abaixo do local da injeção entre o polegar eo indicador da mão, use a outra mão para injeção. Antes da injeção verifique se não há bolhas na seringa (usando 30 1/2 G agulha e seringa de 1 ml). Inserir a agulha e injetar o vetor lentamente. Se a agulha se encontra na veia, um flash de sangue pode ser visto no cubo da agulha e também não há resistência durante a injecção. Depois de retirar a agulha, segure o local da injecção com uma gaze para parar a hemorragia antes de retornar ratos to gaiola. Se a agulha não está na veia existe uma resistência significativa a injecção subcutânea e um pouco wheal surge. Neste momento, remover a agulha e tente novamente em um local diferente. 3.3 Análise dos efeitos de HDAD-Ngn3 + HDAD-Btc tratamento. Monitor de glicemia de jejum 6 horas e peso corporal semanal após o tratamento vetor. Recolha de sangue a partir da veia safena ou na veia da cauda na perna a cada 2 semanas para a insulina ensaio (Mouse Insulin ELISA kit, Mercodia) e as enzimas do fígado (ALT e AST Infinito Reagentes, Thermo Scientific), utilizando-se kits comerciais. Colocar o rato em 50 ml de um tubo Falcon não nivelada com furos feitos na extremidade fechada. A cabeça do rato é na extremidade fechada do tubo, e as pernas e a cauda no lado aberto do tubo. Para a recolha de sangue a partir da perna esquerda, estender a perna esquerda exterior do tubo e aperte suavemente a pele da coxa com o polegar eo dedo indicador para imobilizar a perna. Usaruma máquina de barbear para remover o pêlo da canela / área inferior da perna, para expor a veia safena, a qual está presente na face lateral da parte inferior da perna. Limpe a pele raspada com álcool a 70% e deixe secar. Punção da veia safena com uma agulha de calibre 25, Coletar o sangue com Microvette tubo CB300 (Sarstedt) e colocar os tubos no gelo. Pressione o local da punção com gaze para parar o sangramento antes de retornar os ratos para as gaiolas. Centrifugar os tubos a 3000 xg durante 5 min, o sobrenadante ter e armazenar a -20 ° C para análise posterior. 3,4 Execute teste de tolerância à glucose (GTT) em 6 semanas após o tratamento. Dissolvido em D-glucose (Sigma) em água destilada para obter 15% de glucose (15 g / 100 ml) e glucose estéril do filtro. Camundongos rápidos para 6 horas. Use almofada quente para aquecer os ratos e coletar o sangue (0 ponto de tempo min). Em seguida, injectar 1,5 g / kg de D-Glucose-ip (10 ul / g de glucose a 15%). Colleccionar sangue aos 15, 30, 60, 120 min. Medir a glicose e de insulina em todas as amostras. 3,5 Tissue análise para avaliar a expressão dos vectores e avaliar a indução de neogénese ilhota. Em todos estes passos os controlos que são necessários para fiavelmente interpretar os resultados incluem: (1) vector vazio tratado ratos diabéticos (2) não diabéticos ratos e (3) do pâncreas não diabéticos que serve como um controlo positivo para a expressão da ilhota hormônios específicos e fatores de transcrição. Colheita fígado e pâncreas em 3 e 6 semanas após o tratamento. Dividir em 2 partes, a primeira pressão para congelação em azoto líquido e armazenamento a -80 ° C para o ARN e a extracção de proteínas, e a segunda para fixar com formalina a 10% durante a noite para análise imuno-histoquímica. Extrair RNA através de um protocolo padrão e analisar a expressão de hormonas específicas dos ilhéus e factores de transcrição, em conjunto com Ngn3 e Btc para confirm vector de expressão, no fígado por qRT-PCR utilizando iniciadores específicos 9, 10. Extrair insulina e peptídeo C a partir do fígado de ácido-etanol método de extracção e quantificação por um ELISA comercial (kit de ensaio ultra-sensível à insulina, Mercodia, péptido-C ELISA kit, Wako). Executar a imunocoloração para hormonas específicas dos ilhéus (insulina, glucagon, PP, SST), juntamente com os factores de transcrição específicos dos ilhéus em secções embebidas em parafina 9, 10. A expressão de Ngn3 e Btc também pode ser confirmada por imunocoloração. 4. Resultados representativos Nós clonado Ngn3 e Btc cDNA em pΔ28 vetores dirigidos por onipresente promotor eIF2a (BOS) e gerou HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC. Como mostrado na Figura 2, a contaminação HV relativo diminuiu significativamente (implicando a amplificação mais vector e amplificação menos helper) a passagem 3. Portanto, utilizou-se para a produção de vector P3 subsequente. Após o primeiroGradiente descontínuo de CsCl e ultracentrifugação, foi colhida a menor banda de vector e, em seguida, recolhida a banda correspondente ao vector opalescente HDAD na ultracentrifugação segundo (Figura 3). O vector purificado HDAD tinham menos de 1% de contaminação HV (Figura 4A) por qPCR e não tinha nenhuma contaminação helper visível na mancha de Southern (Figura 4B), indicando uma qualidade suficiente para perfusão vector em ratinhos. Uma análise adicional incluída a expressão do transgene por infecção de células 116. Os níveis de mRNA de expressão de Ngn3 e Btc foram maiores nas células infectadas por vector mais de 10.000 vezes em comparação com os de células não infectadas (Figura 5). HDAD Ngn3-e-Btc foram então administradas a STZ induzidas ratos diabéticos através de injecção na veia da cauda com o vector vazio e injectado HDAD-BTC ratos diabéticos injectados que servem como controle negativo. Hiperglicemia foi invertida e glucose-secreção de insulina estimuladafoi restaurada em ratos tratados tanto com HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC, mas não em ratos tratados com vector único gene ou vector de controlo vazio (Figura 6). O HDAD-Ngn3-Btc tratamento induzida ilhota neogénese e este foi quantificado por análise de conteúdo de insulina e peptídeo C-total (Figura 6E) com não diabéticos, diabéticos ratos tratados vetor vazios que servem como controlos. A presença de c-peptídeo e insulina em proporções equimolares confirma que a insulina ser detectado no fígado é de facto a ser sintetizada no fígado. RT-qPCR confirmou que o fígado de HDAD-Ngn3-BTC ratos tratados expressa todas as hormonas das ilhotas específicos e de factores de transcrição 9. A imuno-histoquímica mostrou células de insulina positivas no fígado de ratos tratados com HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC, mas não as células de insulina positivas foram observadas em ratinhos tratados com o vector de controlo (Figura 7). Nós também confirmou que não havia ilhotas residuais no pâncreas do treate Ngn3-Btcd ratinhos, em comparação com as ilhotas numerosos em não-diabéticos pâncreas. Vector (Ngn3 e BTC), juntamente com ilhéus factor de transcrição específico da linhagem (Pdx-1 e Nkx6.1) expressão foi também avaliado por imunocoloração do fígado (Figura 7). Figura Fluxograma 1. Da terapia gênica de camundongos diabéticos usando ajudante-dependente sistema de vírus. Em primeiro lugar, e Ngn3 Btc, numa cassete conduzido por um promotor ubíquo BOS, são clonados em HDAD shuttle (pΔ28) vectores. HDAD é produzida por vários passos, incluindo a transfecção, as passagens em série de amplificação, e uma infecção em grande escala, seguida de purificação do vetor. Após a caracterização da qualidade, HDAds são injectadas por via intravenosa em STZ induzidas ratos diabéticos através da veia da cauda. Os efeitos do tratamento são avaliados através de medição de glicose, peso corporal, TTG e por análises de expressão de genesno fígado. Figura 2. Determinação amplificação vector HDAD. O DNA é extraído de passagem para P0 P4 utilizando kits de extração de DNA (Qiagen). DNA DNA é diluída 1.000 vezes e 5 uL é utilizado para PCR em tempo real (qPCR). Primers auxiliares e vetor específico são utilizados. As curvas padrão são geradas através de diluições em série (10 -5 a 1 ng / ml) de HDAD shuttle vector plasmídeo e HV plasmídeo (painéis superiores). Utilizando as curvas de padrão e os valores de Ct para o número de cópias do vector e vírus auxiliar é calculada e a relação entre HDAD / HV é representada como uma percentagem do total de vírus (helper HDAD +). Assim, a amplificação vetor relativo é calculado como: [número de cópias do vetor / (vetor + número cópia vírus auxiliar)]. No exemplo mostrado (painel inferior) de amplificação vector HDAD estabilizou em P4, enquanto o HDAD relativa / HV está aumentando em P3. Portanto, P3 é seleccionado para o passo subsequente. Figura 3. Bandas vetor representativos HDAD após ultracentrifugação de densidade descontínuo de CsCl. Vector HDAD é purificado a partir de uma cultura giratório 3L sobre gradiente de densidade de CsCl sequencial. (A) Após a ultracentrifugação em gradiente de densidade primeiro, uma banda opalescente único vector é visível (seta) a seguir restos celulares opaco (CD). A banda opalescente (seta) é recolhido para a segunda centrifugação em gradiente de densidade. (B) Após a ultracentrifugação segundo gradiente de densidade, a banda opalescente (seta) é recolhido para diálise. Figura 4. Análise de contaminação do vírus auxiliar. O DNA é extraído a partir de 50 ul de vírus purificado e de contaminação é um auxiliarssessed como na Figura 2. A figura mostra a contaminação ajudante de HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC é inferior a 1%. Figura 5. Análise da estrutura do vector HDAD. Southern blot é realizada como descrito anteriormente (Oka K, et al.). Pista 1: DNA de vírus auxiliar; Pista 2: ADN de P3; Pista 3: DNA de P4; Pista 4: vectopr purificada. Setas abertas indicam as bandas de vírus ajudante de derivados, e as setas indicam as bandas cheias ITR derivadas do vector HDAD. Figura 6. O nível de expressão de Ngn3 ou Btc em 116 células infectadas com o vector HDAD-Ngn3 ou HDAD-BTC. 116 células em placas de 12 poços a estão infectadas com o vector HDAD-Ngn3 ou HDAD-Btc ou vazio a 1000 vp / célula durante 2 dias. Cells são colhidas e o RNA total é extraído usando o reagente Trizol. qRT-PCR é realizada utilizando-Ngn3 Btc ou iniciadores específicos. O Ngn3 relativa ou expressão de mRNA Btc aumentou mais de 10.000 vezes em células infectadas com HDAD-Ngn3 ou HDAD-BTC. A figura é reproduzido a partir Dev.Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73; Yechoor et. ai., com a permissão da Elsevier. Figura 7. A transferência de genes de HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC em ratos STZ-diabéticos induzidos conduz à reversão de diabetes e indução de neogénese ilhota no fígado. (A) A glucose do plasma e (B) de peso corporal de ratos STZ-induzidos diabéticos tratados com HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC. (C) de glucose e insulina do plasma durante um IP-GTT menos 6 semanas após o tratamento. (D) coloração representativas insulina no fígado 12 semanas após o tratamento. * P <0,05 (versus grupo de vector vazio). A figura é reimpresso de Dev. Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73; Yechoor et al, com permissão da Elsevier.. nome primer forward reverter cartilha ajudante GACCATCAATCTTGACGACC ATGTCGCTTTCCAGAACCC vetor TTGGGCGTAACCGAGTAAG ACTTCCTACCCATAAGCTCC Ngn3 AAGAGCGAGTTGGCACTCAG TCTGAGTCAGTGCCCAGATG Btc GCACAGGTACCACCCCTAGA TGAACACCACCATGACCACT Tabela 1. Sequências de iniciadores.
