CRISPR / Cas системы промежуточного адаптивного иммунитета у бактерий и архей. Многие белки Cas предлагается в качестве endoribonucleases, действующих на прекурсоров crRNA различной длины. Здесь мы проиллюстрируем три различных подхода для получения предварительного crRNA субстраты для биохимического анализа деятельности эндонуклеазы Cas.
The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5′ terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5′ terminal (8 nucleotides) and a 3′ terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5′-hydroxyl and a 2′,3′-cyclic phosphate termini.
Представленные методы позволяют поколения Cas субстратов эндонуклеазы различных диапазонов размеров и с различной последовательности свободы в дизайне. Наиболее прямым подходом для создания синтетических олигонуклеотидных субстратов РНК ограничено коротким конструкций РНК в связи с ростом затрат и технических ограничений в создании больше РНК олигомеров. В то время как успешный синтез РНК сообщалось немодифицированных олигомеров РНК длиной более 100 нуклеотидов, практичный и экономичный максимальная для пользовательского синтеза РНК лежит ниже 40 нуклеотидов. Однако любой заданной последовательности могут быть синтезированы и целевых введения модифицированные нуклеотиды (например, дезоксирибонуклеотиды) могут быть использованы для анализа сайтов расщепления в деталях. Более предварительно cRNAs должен быть сформирован через в пробирке транскрипции.
Отжига олигонуклеотидов, которые содержат РНК-полимеразы Т7 промотора позволяет для производства промежуточной длины предварительно crRNКак. Максимальная длина регулярно и экономически синтезировали ДНК-олигонуклеотидов чуть выше 150 нуклеотидов и представляет собой максимальное синтетических предварительно crRNAs с помощью этого метода. Сборка из нескольких отожженной ДНК олигонуклеотида пар, которые образуют липкие концы друг с другом может продлить этот максимальной длины, но требует увеличения проблем в клонировании конструкции. Основным преимуществом этого метода является возможность генерировать предварительно crRNA конструкции (и, следовательно, Cas эндонуклеазы субстратов) с любой желаемой последовательности. Это позволяет испытания синтетических конструкций crRNA.
Наконец, большие предварительного crRNAs может быть получен из amplificates ПЦР всей геномной CRISPR элементов или их фракций. Внесены изменения в пробирке транскрипции шаблон плазмиды могут быть введены с помощью сайт-направленного мутагенеза для создания предварительного crRNA вариантов. Эти конструкции могут быть использованы для анализа глобальных endonucleolytic картина расщепления в течение всейпредварительно crRNA.
Пионерские работы по производству немодифицированных РНК с помощью РНК-полимеразы T7 в пробирке транскрипции был основан на передаче 14 и РНК вируса мозаики костра РНК 15. Консенсус T7 РНК-полимеразы промоутер состоит из признания домена (-17 через -5) и инициирование области (-4 через +6) с инициации транскрипции при существенной гуанозин +1 16. Позиции ниже +1 может быть изменена, которая позволяет транскрипции практически любой желаемой последовательности РНК. Представленные методы генерации в пробирке стоки шаблоны транскрипции позволяет в пробирке синтеза полного предварительного crRNAs, которые соответствуют геномных регионов CRISPR или синтетические предварительно crRNA вариантов. Транскрипты, созданные с 5'-трифосфат терминала настоящему, если транскрипция реакции загрунтовать GMP для получения 5 'монофосфат концы 14. Такие концы необходимо, если стенограммы должны быть помеченыТ4 полинуклеотидкиназы и γ-[32 P]-ATP. Расщепление деятельности Cas6 и Cas6-подобных ферментов создает crRNA, которые содержат 5'-гидроксил и 2 ', 3'-концах циклического фосфата. Эти РНК могут быть проанализированы для признания Каскад комплекс.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Jeanette Schermuly для получения рекомбинантных РНК-полимеразы Т7 и Норман Ebelt за помощь в подготовке рисунке 1. Эта работа финансировалась за счет средств от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) и Общества Макса Планка.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |