Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay
Summary
Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri uğrar<sup> 1,2</sup>. Burada basit bir tarif<em> Ex vivo</em> Nörülasyonu sırasında kraniyal mezenşimi ve hücresel davranışları karakterize tahlil eksplantasyona. Bu testte farmakolojik manipülasyonlar ve canlı görüntü analizlerinin mükellef olması dahil birçok uygulama vardır.
Abstract
Merkezi sinir sistemi Nörülasyonu gibi bilinen bir işlem nöral tüp oluşumu ile sonuçlanan kompleks morfogenetik bir dizi hareket geçer sinir plaka elde edilir. Nörülasyonu sırasında nöral plakayı temelini mezenşimi morfogenezi nöral kat yüksekliği sürücü inanılıyor. Kranial mezenşimi paraxial mezoderm ve nöral krest hücrelerinden oluşur. Kraniyal mezenşimi formun hücreleri yıldızsı şekilli hücrelerden oluşan ve nöral kıvrımlar destekleyen ekstrasellüler matriks (ECM) ipliklerini karışmasının bir pourous ağ örgüsü. Nörülasyonu sırasında kraniyal mezenşimi genişlemesi sonucunda basmakalıp çevrilme uğrar ve bu hareketlerin nöral kat yüksekliği için bir itici güç sağlamak için inanılıyor. Ancak, kranial mezenşimi morfolojilerinden sürücü yolları ve hücresel davranışları kötü okudu kalır. ECM ve kafatası mezenşim underly thes hücreler arası etkileşimleriE hücre davranışları. Burada bu hücrelerin davranışlarını karakterize etmek için tasarlanmış basit bir ex vivo eksplant tahlil açıklamaktadır. Bu testte daha bu hücrelerin davranışını karakterize etmek dahil sinyalizasyon yolakları ve canlı görüntüleme analizleri incelemek için farmakolojik manipülasyonlar iyileştirilebilir. Bu ECM bileşenlerinin çeşitli kafatası mezenşim ve göç özelliklerini karakterize etmek için bu tahlil yararlarını gösteren temsili bir deney sunulmaktadır.
Introduction
Kranial bölgede Nöral tüp kapanma embriyonik gün 8,5 (E8.5) ve fare embriyo 9.5 arasında gerçekleşir. Düzgün anensefali, insanlarda ortak yapısal bir doğum kusuru merkez sonuçlar nöral tüp kapatmak ve Başarısızlık hayat ile uyumsuz. Sefalik nöral tüpün kapanmasında sürücü kuvvetler nöral doku kendisi ve çevresindeki epidermis ve mezenşimi 3 hem de üretilir. Kraniyal mezenşimi Özellikle genişlemesi kranial nöral kıvrımlar 1,2 yükselmesine için gerekli olduğu düşünülmektedir. Kranial mezenşimi heparin sülfat proteoglikan, kondroitin sülfatlar ve hyaluronat 4-8 gibi belirli glikozile proteinler ECM proteinleri bakımından zengindir.
Nöral krest hücreleri nöral tüp kapatılması sonrasında dorsal nöral tüp göç tavuk embriyo aksine, fare embriyo nöral krest nöral kıvrımlar r başlaması aynı zamanda göçimkb (5 somite aşamasından sonra). Böylece fare embriyo Nörülasyonu sırasında, kafatası mezenşim nöral tepe ve paraxial mezoderm türetilmiş hücrelerden oluşur. Nöral krest ve paraxial mezoderm nüfus gelişimi farklı zamanlarda indüklenir; embriyonun farklı pozisyonlarda lokalize ve farklı yapıları 9,10 dönüşebilir. Paraxial mezoderm primitive streak kaynaklanan ve varsayımsal nöral plakayı rol oynadığı embriyo ön bölgeye göç eder. Nöral krest nöral plak ve epidermal ektoderm kavşağında indüklenir, geçiş mezenşimin bir epitel uğrar ve kemirgen embriyoda nöral kat yüksekliği hemen önce delaminates. Nöral krest hücrelerinden branşiyal kemer, frontonasal ve perioküler mezenşimi için subectodermal paraxial mezoderm içinde stereotipik yollar boyunca göç ederler. Paraxial mezoderm kafatasının ve yüz kasları kemiklere bazı katkı sağlayacak; oysa inciE nöral krest kranial sinirler 9-11 yanında kafatası ve yüz kemiklerinin diğer katkıda bulunacaktır. Paraxial mezoderm ve nöral krest soylar ayirt sırasıyla 9 Mesp1-cre ve Wnt1-CRE transgenik fare hatları ile işaretlenmiş olabilir.
Nöral tüpün kapanmasında kranial mezenşimi hayati rolü deney ile kanıtlandı olmuştur nerede ECM, Nörülasyonu düşüklüğüne nöral tüpün kapanmasında 7 sırasında hyalüronidaz chondroitinase ABC, heparitinase veya Diazo-okso-norlösin (DON) gibi ajanların bozucu olan kemirgen embriyo tedavisi, 12-14. Bu deneylerde, Nörülasyonu sonrasında statik bölümlerinin histolojik analiz kraniyal mezenşimi 7,12-14 arasında ilişkili dysmorphogeneis saptandı. Teratojenik ajan birden dokulara erişimi beri Ancak, kranial mezenşimi gerçekten hedef doku olup olmadığını tespit edilecek kalır. Sonuç destek olarak bu dokuNörülasyonu için gerekli olan, kraniyal mezenşimi eksensefali 15-17 ile bazı fare mutantlar histolojik analizler üzerine anormal görünür. Yine de, çoğu durumda, kafatası mezenşim bir hücresel davranışı üzerindeki mutasyon etkisi giderilmiş değildir.
Biz doğrudan kranial mezenşimi hücreleri 15 davranışı üzerinde genetik bir mutasyon ya da farmakolojik manipülasyon sonucu incelemek için bir ex vivo eksplant tahlil geliştirdiler. Bu tahlil, kranial mezenşimi farklılaşma potansiyeli ulaşmak için Tzahor ark 2003 tarafından yayınlanan benzer olduğunu temelini anterior nöral temelini biz kranial mezenşimi daha ön nüfusun göç özelliklerini incelemek için eksplant diseksiyon değiştirdiyseniz hariç rhombomeres 18 plaka. Bizim yöntemi de ke ile nöral krest göç davranışlarını analiz etmek tavuk embriyo gerçekleştirilen eksplant deneyleri bir değişikliky farklılıklar. Önceki hazırlıkları nöral krest veya daha posterior paraxial mezoderm 19,20 eksplante oylandı. Ayrıca, tavuk embriyosunda nöral kat yükselmesi sırasında, nöral krest henüz dorsal nöral tüp göç olmamıştır ve böylece anterior paraxial mezodermin alınan eksplantlar nöral krest hücreleri içeren olmaz. Bizim analizde, paraxial mezoderm, nöral krest ve yüzey ektoderm oluşan kranial mezenşimi eksplantlar bir substrat üzerine hazırlanan ve kaplanır. Genetik mutantlar gelen eksplant izolasyon, farklı ECM veya farmakolojik tedaviler eksplantlar kaplama dahil Deneysel manipülasyon yapılabilir. Eksplant ve mesafe, sayısı ve davranış Hücreler göç analiz ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, bu hazırlık canlı görüntüleme teknikleri ile hücresel göç analizleri iyileştirilebilir. Kürk göç deneyden sonra, eksplantlar tespit edilebilir ve immünohistokimyasal analizler tabitedavilerin etkisini açıklamak Ther. Genel olarak, burada sunulan protokol kraniyal mezenşimi davranışını araştırmak için basit bir ex vivo bir testtir. Temsilcisi deney olarak, farklı ekstraselüler yüzeylerde kranial mezenşimi göç incelemek için bu testte kullanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada uygulanan yöntem, kranial mezenşimi hücrelerin davranışlarını incelemek için güçlü bir tahlil sağlar. Burada yer alan statik analiz ek olarak, GFP-etiketli proteinlerin ekspresyonu ile parlak saha olarak ya da kombinasyon halinde görüntüleme deneyler yaşayan bunlar eksplant göç gibi, gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilmektedir. Canlı görüntüleme deneyler için, eksplantlar Dii ile etiketlenmiş olabilir veya paraxial mezoderm, ROSA-YFP gelen nöral krest göç ayırt etmek; Mesp1-CRE veya ROSA-YFP; Wnt1-CRE veya diğer transgenik hatları kullanılabilir. Kraniyal mezenşimi-ECM etkileşimleri de bu eksplant tahlil kullanılarak incelenebilir. İşte biz bu hücrelerin farklı derecelerde bunlar üzerinde göç ve ECM hücrelerinin morfolojisini etkilediğini göstermek için kranial mezenşimi mevcut olan farklı ECM yüzeylerde plaka eksplantlar. Ayrıca, eksplant cel davranışlarını erişmek için üç boyutlu bir matriks içinde gömülü olabilirBu bağlamda ls. Bu eksplant tahlil göç düzenleyen ve değiştirebilirsiniz içsel ve dışsal ipuçlarını analiz kraniyal mezenşimi davranışları üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonlar etkisinin analizine iyileştirilebilir. Örneğin, biz Hectd1 mutant kranial mezenşimi 15 anormal hücre davranışlarını aşırı hsp90 salgı rolü ayırt etmek bizim çalışmalarda bu testte kullanılmıştır. Bu deneylerde, bu Hectd1 mutant hücrelerin anormal davranışları fazla hücre dışı HSP90 15 bağlı olduğunu göstermek için HSP90 salgılanmasını engellemek için anti-HSP90 antikor ile eksplantlar, HSP90 proteini, geldanamycin ve DMA (dimetil amelioride) tedavi edildi. Benzer yaklaşımlar farmakolojik kraniyal mezenşimi normal veya anormal morfolojilerinden altta yatan ek yolları kesmek için kullanılan olabilir. Tahlil tamamlandıktan sonra, eksplantlar ve göç eden hücrelerin yöntemler bir dizi ile analiz edilebilir. Örneğin, immünohistokimyasal analizler cBir hücre hareketleri için kritik proteinlerin yerelleştirme incelemek için istihdam edilecek. Transcriptome analizleri de tedaviler gen ekspresyonu nasıl etkilediğini belirlemek için istihdam edilebilir.
Bu tekniğin bir önemli sınırlama onlar in vivo olarak ortaya çıkıyordu üç boyutlu modeli davranışları değil olmasıdır. Eksplantlar floresan protein-işaretli hücresel bölümlerin ifadesi ile birlikte, üç boyutlu bir matris (örneğin, Matrigel) gömülü olan protokol Modifikasyonu Bu sorunu çözmek için gerekli kullanılabilirdi. Bu değişiklikler yapılmıştır bile, in vivo olarak, bu, bu ex vivo deneyi de görülen davranış ilişkilendirmek için başka deneyler gerekli olacaktır. Diğer sınırlamalar istatistiksel olarak anlamlı verileri oluşturmak için yeterli sayıda üretmek için gerekli embriyoların çok sayıda bulunmaktadır. En önemlisi, diseksiyon nispeten basit, o ana uygulama gerektirir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma için ieZ R01-HD058629 tarafından desteklenmektedir
Riferimenti
- Copp, A. J. Neurulation in the cranial region–normal and abnormal. Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).
- Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies. The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).
- Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. The genetic basis of mammalian neurulation. Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).
- Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence. J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).
- Tuckett, F., Morriss-Kay, G. Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).
- Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).
- Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).
- Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds. Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).
- Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme. Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).
- Noden, D. M., Trainor, P. A. Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).
- Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).
- Morriss-Kay, G., Tuckett, F. Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos. Development. , 106-787 (1989).
- Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation. Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).
- Sarkar, A. A., Zohn, I. E. Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme. The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).
- Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure. Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).
- Chen, Z. F., Behringer, R. R. Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis. Genes Dev. 9, 686-699 (1995).
- Tzahor, E., et al. Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle. Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).
- Lumsden, A. G. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ. Development. 103, 155-169 (1988).
- Newgreen, D. Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin. Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).
- Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).
