Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

1. Preparação de Pratos Cultura ECM revestidos ou Lamelas Preparar solução de ECM por dissolução ECM substrato em PBS (Dulbecco tamponada com fosfato, Invitrogen, # 14040-133). Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 milímetros (VWR, # 28145-495) e congelar em alíquotas a -80 ° C. Diluir ECM solução estoque em PBS a uma concentração desejada. Para MaxGel, dilua em meio DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, Invitrogen, # 11995-065). Se imunofluorescência será executada, esterilizar 12 milímetros lamelas de vidro circulares (VWR, # 89015-724), por imersão em etanol e deixar secar ao ar. Isto deve ser feito na capa laminar estéril. Se imunofluorescência não será realizada pule para o passo 1.5. Lugar esterilizada lamelas em cada poço de uma placa de 24 poços (Corning, # 3526). Adicionar 0,5 ml de solução de substrato diluído a cada poço da placa de 24 poços e incubar à temperatura ambiente durante 3 hr. Aspirar a solução de ECM e lavar threE em tempos de PBS. Aspirar PBS e utilizar imediatamente, ou enrolado em parafilme e armazenadas a 4 ° C durante até 2 semanas. 2. Preparação de instrumentos de dissecação Placas Sylgard com carvão adicionado são preparadas por protocolo do fabricante. O fundo preto resistente destas placas fornece suporte para a fixação do embrião para baixo e a cor oferece um bom contraste que facilita a visualização do embrião translúcido. Para preparar pratos pesam diretamente em um copo tri-derramar sobre um equilíbrio Parte 150 g Um líquido 15 g Parte B e 1 pó de carvão g (Instrumentos de Precisão Mundo, # SYLG184). Misture usando um palito de picolé de madeira ou espátula. Despeje em vidro ou plástico de 100 pratos centímetros. Usar um maçarico de butano pequena realizou cerca de 10 a 12 polegadas acima dos pratos para queimar as bolhas. Tampas lugar em placas e deixe descansar por pelo menos 24 horas para definir. Para preparar instrumentos de dissecação inserção de um pino Minutien (0,1 milímetros diameter) para um suporte de pino (Belas ferramentas científicas, # e # 26002-10 26018-17, respectivamente), em alternativa, agulhas de calibre 26 (BD, # 309597) dobradas em ângulo recto com o auxílio de uma pinça podem ser utilizados como instrumentos de dissecação. Afiadas Estudante Dumont # 5 Fórceps (Ferramentas Ciência Fine, # 91150-20) usando uma pedra de amolar (Belas ferramentas científicas, # 29008-22). Esterilizar todas as ferramentas de dissecação com etanol 70% antes da utilização. 3. Coleta de embriões Euthanize o mouse cronometrado grávida de 8,5 post coitum dias de acordo com os regulamentos da comissão de animais de uso e remover útero. Útero lugar em uma placa de Petri de plástico com PBS estéril. Lavar uma vez com PBS útero estéril. Sob um microscópio de dissecção remova cuidadosamente embrião do deciduas usando um par de fórceps. Remover Membranas Extra-Embrionárias e salvar para a genotipagem, se necessário. Fase embrionária através da contagem somitos. Os estágios ideais para fazer explantes para analisar celular behAvior durante a elevação vezes neural seria entre os 6 e os 10 estágios somito quando as pregas neurais estão apenas começando a elevar e antes da morfogênese principal do mesênquima craniano ocorre. Lavar embrião em PBS. Coloca-se num prato de Sylgard preto com DMEM que contém nenhuma vermelho de fenol (Invitrogen, # 21063-029). Remova as membranas extraembryonic e salvar para a genotipagem, se necessário. 4. Preparação de Explantes Recentrar o microscópio com a ampliação mais elevada possível ao longo da região da cabeça do embrião. Faça cortes com uma agulha de dissecção em cada mão. Use uma agulha para manter o tecido no seu lugar e o outro para fazer cortes. Cortar a cabeça do embrião anterior aos rhombomeres. Corte ao longo da linha média para bifurcar a cabeça em duas metades iguais. Corte em torno das franjas exteriores da cabeça e linha média. Estes cortes vão remover a crista premigratory e ectoderme superfície na fronteira externa ea placa precordial na linha média. O tecido remanescente será o explante e irá conter a migração de crista neural cranial, mesoderme e ectoderme superfície paraxial. À medida que o tecido é cortado, remover detritos dissecado do prato usando uma pipeta de pasteur estéril. Isto impede confundir o explante com os restos dissecados. Delicadamente, lave o explante pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 20 ul ponta e Pipetman. Isto irá remover células frouxamente ligados e evitar bordas irregulares em explantes. Cuidadosamente pegar cada explante em cerca de 10 uL de líquido utilizando uma pipeta de 20 uL e ponta Pipetman e lugar no centro da cultura revestida. Adicionar 20 ul de meio de cultura suplementado com 15% de FBS para cobrir o explante. Colocar a placa numa incubadora de cultura de tecidos humidificada (5% de CO 2, 37 ° C) durante 1-2 horas para permitir que o explante para prender a parte inferior do prato. Ver periodicamente para garantir que o explante não secapara fora. Quando o explante tem anexado, cuidadosamente adicionar a cada cavidade 250 ul de DMEM suplementado com FBS a 10% que foi aquecida a 37 ° C em banho-maria. Uma vez explantes foram ligados eles não se movem quando o prato é suavemente agitada sob microscópio. Retornar ao prato de cultura de tecidos incubadora. Após 24 h, os explantes serão solidamente presas e células vão começar a emigrar. Neste momento agentes farmacológicos podem ser adicionados aos meios de comunicação. 48 h após o plaqueamento, as células migraram a partir dos explantes. A distância migrada pode ser visualizada e impressa. Nós normalmente parar a cultura neste ponto desde explantes começam a mostrar sinais de viabilidade diminuiu com incubações mais longos. Um corante vital tal como laranja de acridina ou azul tripano pode também ser usado para verificar a viabilidade do explante. Neste ponto, as imagens podem ser adquiridas para documentar a distância e o número de células que migram a partir do explante. Alternativamente, se explantes foram semeadas em lamelas,eles podem ser corrigidos e as análises de imuno-histoquímica realizada para visualizar as proteínas de interesse. Etapas críticas no protocolo Cortar os explantes de aproximadamente o mesmo tamanho. Limpar todos os detritos dissecção fora do prato dissecar como você está dissecando para evitar detritos confuso com o tecido desejado explantado. Quando explantes revestimento em poços ou em lamelas se esqueça de colocar gota de mídia com explante no centro de bem. Permitir explantar tempo suficiente para prender antes de inundar o bem com a mídia. Condições de tratamento deve ser padronizado para cada substrato de teste e agente farmacológico usado. Dois explantes podem ser feitas a partir de cada embrião (um do lado esquerdo e uma do lado direito do tubo neural). Ao testar a migração de células a partir de linhas de ratinhos mutantes em diferentes condições experimentais, colocar um explante mutante no grupo de controlo e outro do grupo tratado. Solução de problemas Se explantes não anexar, aumentar o tempo previsto para a fixação. Na nossa experiência, cerca de metade dos explantes não atribuem e explantes maiores aderir de forma mais eficiente. Se explantes anexar a periferia do poço que será difícil de imagem. Certifique-se de colocar explantes no centro do poço. Idealmente explantes serão de aproximadamente o mesmo tamanho. No entanto, diferenças no tamanho do explante pode ser corrigido para a utilização do diâmetro dos explantes como um factor de correcção, quando quanitating migrações de células a partir de explantes. Se ocorrer contaminação ter certeza estéreis as condições de trabalho estão sendo usados. Todas as ferramentas e superfícies de trabalho devem ser esterilizados com etanol a 70%. Pipetas e placas de Petri devem ser nova e estéril. Se explantes estão se perdendo durante a dissecção, periodicamente, remover detritos para evitar a perda de explante. Dominando a dissecção é demorado e requer prática. Optimal ampliação, afiados instrumentos de dissecação e ajuda de agulhas.