JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Новый метод скрининга для направленной эволюции термостабильных ферментов Бактериолитические

Published: November 07, 2012
doi:
10.3791/4216
,
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research,University of Maryland

Summary

Роман направленной эволюции метода, специфичные для области термостойкости инженерных была разработана и утверждена, следовательно, для бактериолитический ферментов. После всего лишь один тур случайного мутагенеза, развивались бактериолитический фермент, PlyC 29C3, отображаемых в два раза превышает остаточную активность по сравнению с белком дикого типа после повышенной температуры инкубации.

Abstract

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not associated with the protein in nature. Literature has provided numerous examples regarding the implementation of directed evolution to successfully alter molecular specificity and catalysis1. The primary advantage of utilizing directed evolution instead of more rational-based approaches for molecular engineering relates to the volume and diversity of variants that can be screened2. One possible application of directed evolution involves improving structural stability of bacteriolytic enzymes, such as endolysins. Bacteriophage encode and express endolysins to hydrolyze a critical covalent bond in the peptidoglycan (i.e. cell wall) of bacteria, resulting in host cell lysis and liberation of progeny virions. Notably, these enzymes possess the ability to extrinsically induce lysis to susceptible bacteria in the absence of phage and furthermore have been validated both in vitro and in vivo for their therapeutic potential3-5. The subject of our directed evolution study involves the PlyC endolysin, which is composed of PlyCA and PlyCB subunits6. When purified and added extrinsically, the PlyC holoenzyme lyses group A streptococci (GAS) as well as other streptococcal groups in a matter of seconds and furthermore has been validated in vivo against GAS7. Significantly, monitoring residual enzyme kinetics after elevated temperature incubation provides distinct evidence that PlyC loses lytic activity abruptly at 45 °C, suggesting a short therapeutic shelf life, which may limit additional development of this enzyme. Further studies reveal the lack of thermal stability is only observed for the PlyCA subunit, whereas the PlyCB subunit is stable up to ~90 °C (unpublished observation). In addition to PlyC, there are several examples in literature that describe the thermolabile nature of endolysins. For example, the Staphylococcus aureus endolysin LysK and Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 and Pal lose activity spontaneously at 42 °C, 43.5 °C and 50.2 °C, respectively8-10. According to the Arrhenius equation, which relates the rate of a chemical reaction to the temperature present in the particular system, an increase in thermostability will correlate with an increase in shelf life expectancy11. Toward this end, directed evolution has been shown to be a useful tool for altering the thermal activity of various molecules in nature, but never has this particular technology been exploited successfully for the study of bacteriolytic enzymes. Likewise, successful accounts of progressing the structural stability of this particular class of antimicrobials altogether are nonexistent. In this video, we employ a novel methodology that uses an error-prone DNA polymerase followed by an optimized screening process using a 96 well microtiter plate format to identify mutations to the PlyCA subunit of the PlyC streptococcal endolysin that correlate to an increase in enzyme kinetic stability (Figure 1). Results after just one round of random mutagenesis suggest the methodology is generating PlyC variants that retain more than twice the residual activity when compared to wild-type (WT) PlyC after elevated temperature treatment.

Protocol

1. Определение оптимальных условий отопления Во-первых, необходимо экспериментально определить оптимальную температуру инкубации и время, чтобы использовать для отопления шагом в анализе. Для наших PlyC модели, важно отметить, что Е. палочка совместно трансформировали plyCA и plyCB генов на отдельных плазмид выражение было показано, образуют полнофункциональную PlyC холофермента 6. 96-луночные подготовки пластины микротитровальных, а также рост клеток условий и последующий метод покрытия реплики были адаптированы из примеров, приведенных в литературе 12-16. Инкубационный период от 30 минут будет подходящим для этого анализа, как результаты предыдущих экспериментов тепловой инактивации диктовать быстрой потери активности при краткосрочной инкубации в среде, превышающих физиологическую температуры (неопубликованные наблюдения). Оптимальная температура инкубации в течение PlyC было выяснено следующее: Transform выражение конструкция pBAD24: plyCA (Amp г) в компетентные E. Штамм DH5α pBAD33: plyCB (см г). Плита трансформантов на Лурия-Bertani (LB) агаром дополнить ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (35 мкг / мл). Инкубируйте пластины течение ночи при 37 ° C. С стерильной зубочистки, привить отдельные колонии в каждом ряду скважин (рис. 2, а) в стерильном, ясно, плоскодонных 96-луночных, крышками планшет, который содержит 200 мкл LB дополнены ампициллин и хлорамфеникол. Безопасное место 96-луночный планшет микротитровальных на 37 ° C инкубатор и вырастить бактерии в течение ночи при 300 оборотах в минуту. Получение 96-луночный планшет микротитровальных от 37 ° C инкубатор и реплики пластину на новую 96-луночный планшет микротитровальных следующим образом: Добавить 180 мкл LB дополнены ампициллин и хлорамфениколВ каждую лунку реплики пластины. Передача 20 мкл бактерий из оригинальной пластины в соответствующие скважины в реплике пластину. Это должно привести к начальной OD 600 ~ 0,5. Безопасное место реплики пластины на 37 ° C инкубатор и Инкубировать в течение 1 часа при 300 оборотах в минуту, затем добавьте inductant. В случае pBAD системы экспрессии, inductant составляет 0,25% арабинозу. Другие системы экспрессии могут потребоваться различные inductants. Поместите пластину назад на 37 ° C инкубатор и дрожание со скоростью 300 оборотов в минуту для 4 дополнительных часа для обеспечения экспрессии белка. Уровни экспрессии обычно колеблется в пределах 10-20 мкг PlyC. После экспрессии белка пришла к выводу, извлечь пластину реплики и гранулах бактерий путем размещения 96-луночный планшет микротитровальных в охлаждаемой центрифуге, которая содержит бакет-ротора, что соответствует 96-луночные планшеты для микротитрования. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре. Извлеките носитель супернатант медленно обращения планшет и аккуратно переливание средств массовой информации. Лизиса клеток путем добавления 50 мкл B-PER II бактериального реагента Добыча белки в каждую лунку. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин. Увеличение объема в каждую лунку по 120 мкл путем добавления 70 мкл фосфатным буферным раствором (PBS) рН 7,2. Пелле нерастворимые продукты распада клеток, крутя пластинки в 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C в охлаждаемой центрифуге. Передача 110 мкл растворимый лизат нефти в соответствующие лунки 96-луночного амплификатора. Используя 30 мин в заданном времени инкубации, подвергать растворимые лизатов в настоящее время проживают в 96 и амплификаторе пластины для широкого круга градиента температуры охватывающей 15-20 ° С. Отметим, что целью является определить, на какой температуре частности фермент теряет> 95% каталитической активности. После инкубирования, инкубировать 96-аамплификаторе пластины при температуре 4 ° C в течение 5 мин и передачи 100 мкл лизатов с растворимым 96-луночный планшет амплификатора в соответствующие скважины в финале 96-луночный планшет. С 12-канальный multipipettor, добавьте 100 мкл ГАЗ штамм D471 в каждую лунку. Обратите внимание, D471 клетки первоначально лиофилизируют из ночи культуры и ресуспендировали с PBS рН 7,2 для получения OD 600 из ~ 2,0. Немедленно поместите 96-луночный планшет в планшет спектрофотометр и мониторинг кинетики ферментов путем измерения OD 600 каждые 15 секунд в течение 20 мин. Самая низкая температура инкубации, что соответствовало скважин, которые не имели изменения оптической плотности (ΔOD ≤ 0,1) определяется как не-допустимой температуре. После широкого экрана температуры выполняется с целью выявления не-допустимая температура, тем выше действия можно повторять в течение более узком диапазоне температур (5 ° -10 ° C) до выясненияточно, не допустимая температура для фермента интерес. Обратите внимание, что без разрешительных температуры, указанных в этом анализе могут быть различными, чем температура плавления выяснить с помощью других средств из-за различий в объеме, концентрация и т.п. 2. Создание библиотеки мутантов Создание мутантов библиотеке пройти обследование включает в случайном включении мутаций ошибок ДНК-полимеразы с минимальным уклоном в нуклеотидной ген plyCA помощью GeneMorph II Kit Случайный мутагенез следующим образом: Дизайн нуклеотидных праймеров с похожими температуры плавления (T м) между 55-72 ° C с ограничением сайтах выбор на 5 'и 3' концах гена plyCA. Поскольку желаемый частота мутаций составляет 2-3 нуклеотидов в plyCA (1,4 кб), используют ПЦР концентрации компонентов, а также амплификаторе условиях, рекомендованных заводом-изготовителем для низких F мутацииrequencies (0-4.5 за кб). Клонирование генов мутагенизированных plyCA в вектор экспрессии pBAD24. Преобразование конструкций в DH5α pBAD33: plyCB фон и пластины трансформантов на LB агаром дополнить ампициллин и хлорамфеникол. Кроме того, преобразования и пластины DH5α pBAD33: plyCB с выражением вектора pBAD24, содержащий ген WT plyCA. Колонии с этой пластинки будет служить контроля во время скрининга. 3. 96 лунок Подготовка плиты Микротитровальные и условия роста клеток Заполните каждую лунку 96-луночный планшет микротитровальные 200 мкл LB дополнены ампициллин и хлорамфеникол. После схеме планшет (рис. 2б), тщательно выбирать отдельные колонии с ночлегом пластин агар с стерилизованное зубочистку и привить бактерий в назначенное а из 96 микротитровальных плаТе. Важно, чтобы гарантировать, что только одна колония на лунку засевают. Встряхните надежно закреплены 96-луночный планшет микротитровальных на 300 оборотов в минуту в течение ночи при 37 ° C. 4. Реплика покрытие, индукция экспрессии белков и Lysate подготовка Выполните шаги 1.5-1.11 из раздела "Определение оптимальных условий отопления" с одной модификацией. Храните оригинальные пластины при 4 ° С после стадии реплик покрытие пришел к выводу. После шаг 1,11, передача 110 мкл лизатов растворимого сырья в соответствующие лунки 96-луночный планшет амплификаторе за исключением положительного контроля скважин A1-D1. Что касается положительных лизатов управления (т.е. лизатов, которые не нагреваются), передачи 100 мкл лизатов в соответствующие скважины в новом 96-луночный планшет микротитровальных, который будет служить в качестве окончательного пластины теста для эксперимента и хранить на льду. 5. Растворимые Lysate Термообработка Нагрейте отрицательного контроля и мутантных растворимые лизатов в настоящее время находящихся в 96-луночный планшет амплификатора в амплификатор течение 30 мин при оптимизированных без разрешительных температуры инкубации определяются на шаге 1. После не-допустимой температуре инкубации, инкубировать 96-луночный планшет амплификаторе при 4 ° С в течение 5 мин. Передача 100 мкл лизатов с растворимым 96-луночный планшет амплификаторе их идентичными и места в финале 96-луночный планшет анализа микротитровальных, уже содержащий положительный контроль растворимые лизатов. С 12-канальный multipipettor, добавьте 100 мкл ГАЗ штамм D471 в каждую лунку. Немедленно поместите пластину в планшет спектрофотометр. Мониторинг кинетики ферментов путем измерения OD 600 каждые 15 секунд в течение 20 мин. PlyC вариант с прогрессировала термическое поведение определяется как конструкция, которая может уменьшить оригинальной оптической плотности на 50 процентов меньше, чем 900 сек прибез разрешительного температуры. Кроме того, положительный контроль (т.е. не с подогревом, WT PlyC) нужно отобразить WT каталитической активности (T 1/2 ≤ 100 сек) и отрицательный контроль (т.е. нагревается, WT PlyC) должен быть лишен активности. После того, как PlyC вариант с прогрессировала термическое поведение определяется, получить оригинальный пластины хранить при температуре 4 ° C и прививать бактерии из отдельных людей, так характерных для мутантов интерес в свежей среде LB дополнены ампициллин и хлорамфеникол. Расти посевной течение ночи при 37 ° C. Извлечение и очистить плазмидной ДНК из культуры, а затем представить для секвенирования с целью выявления нуклеотидных мутаций, которые вывод повышенной термической поведение PlyCA. Кроме того, в дополнение небольшой аликвоты из ночной культуры с 10% глицерина и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

Representative Results

В конце первого раунда случайного мутагенеза, более 6000 PlyC мутанты были обследованы и в общей сложности 35 мутантов с потенциально увеличить термическое поведение было выявлено, выбрать и последовательно. Геномного анализа, приведены в таблице I, показывают, что из 35 кандидатов, 7 из конструкций, содержащихся WT PlyCA последовательностей на уровне перевода, соответствующие ложных срабатываний, определенных анализа. Из оставшихся 28 кандидатов, мутации диапазон был от 1 до 6 нуклеотидных мутаций средняя скорость мутации в 2,75 нуклеотидов в гене plyCA, которая была в 2-3 нуклеотидных спектр мутаций, мы были таргетинга. На уровне трансляции, эта нуклеотидная мутация и диапазон частот дали аминокислоты спектр мутаций кислоты от 1 до 5 аминокислот, средняя скорость мутаций на 1,9 аминокислотных мутаций в PlyCA полипептида. Из 28 кандидатов по меньшей мере одной аминокислоты Mutat кислотыиона, четыре из этих мутантных конструкций были случайным образом выбраны для дальнейших исследований для подтверждения, что длительный процесс отбора направленной эволюции методологии действительно функционирует должным образом. Мутант PlyC ферменты очищают до> 95% однородности на основе SDS-PAGE анализа, как описано ранее 6-7. Фермент кинетики WT PlyC и каждая из четырех PlyC мутанты были характерны в равной молярной концентрации после инкубации очищенных ферментов на различных повышенных температурах. Деятельность контролировали после добавления D471 газа путем измерения оптической плотности при 600 нм каждые 15 секунд в течение 20 мин. Деятельность определяется как остаточная максимальной скорости фермента после тепловой инкубации. Из четырех кандидатов, случайно выбранные для дальнейших исследований, мутант 29C3 показала самый повышенной термической поведения. Термическое поведение WT PlyC и 29C3 была исследована при различных температурах, в то время как инкубации и анализа на деятельность в PBS рН 7,2 в80 нМ и 40 нМ концентрации, соответственно. 45-50 ° С инкубационный экспериментов (рис. 3) были выполнены в амплификатор, где образцы инкубировали в тонкостенный 96-луночный планшет амплификатора в общем объеме 120 мкл. 35 ° C, 40 ° C и 45 ° C инкубационный экспериментов (рис. 4 и 5) были выполнены в тепловой блок, где образцы инкубировали в 1,5 мл трубки микроцентрифужных в общем объеме 1,3 мл. Все эксперименты проводили в трех повторах. WT PlyC 29C3 и не показали существенной разницы в кинетическую стабильность при комнатной температуре (25 ° C), как показано в первом множество баров на Рисунке 3. Тем не менее, после краткосрочной инкубации в течение 30 мин с температурой от 45-50 ° C, деятельность 29C3 была существенно выше, чем активность, характерные для WT построить в каждой точке температуры. Например, WT PlyC отображается на 44% потери активности на 45,2° C, тогда как 29C3 показали лишь 2% потери активности при той же температуре. Долгосрочные инкубации исследований, сравнивающих остаточной активности обеих WT PlyC и 29C3 дополнительно были выполнены при температуре 35 ° C и 40 ° C по измерению остаточной активности в 24 и 48 очков час времени. При 35 ° C, 29C3 отображается 41% и 176% выше активность, чем WT PlyC через 24 и 48 ч инкубации моменты времени, соответственно (рис. 4а). При 40 ° C, 29C3 отображается 28% и 107% высокую активность, чем WT PlyC через 24 и 48 ч инкубации моменты времени, соответственно (рис. 4б). Остаточной активности WT PlyC и 29C3 также мониторинг каждые 20 мин в течение в общей сложности 3 часа при 45 ° C. WT PlyC только был в состоянии сохранить 21% активности после 3 ч инкубации при этой температуре в то время как 29C3 удалось сохранить 46% активности. Период полувыведения (Т 1/2) для WT PlyC и 29C3 были на 67 и 147 минут, соответственно, предложить ния, что 29C3 имеет 2,2-кратное увеличение кинетической стабильности при 45 ° C (рис. 5). Всего 1 тур кандидатов 35 Кандидаты с последовательностью WT PlyCA 7 Кандидаты с ≥ 1 мутации Amino кислота 28 – Средняя частота мутаций нуклеотидных (NT / plyCA) 2,75 – Диапазон нуклеотидных мутаций (NT) 1-6 – Средняя частота мутаций Amino Acid (AA / PlyCA) 1,9 – Amino Range Мутация кислоты (AA) 1-5 Таблица 1. Кандидат бассейн геномного анализа. pload/4216/4216fig1highres.jpg "/> Рисунок 1. Режиссер методологии анализа эволюции. В направленной эволюции, человек начинает с ведущим фермент, который будет WT PlyC в первом раунде. Библиотека PlyC мутантов, содержащих случайные беспристрастные нуклеотидных мутаций в гене plyCA затем построены ошибок ДНК-полимеразы, клонировали в вектор экспрессии pBAD24 и превращается в E. Штамм DH5α, уже содержащий pBAD33. plyCB индивидуальных трансформантов вносили в свои специфические лунку 96-луночный планшет для микротитрования. Через широкий процесс отбора, индивидуальный PlyC мутантов, которые являются каталитически активными после инкубации при недопустимых температур классифицируется как мутанты с повышенной кинетической стабильности. Theconstruct отображения наиболее продвинулись термическое поведение будет, следовательно, становится ведущим фермента в следующий раунд случайного мутагенеза. В целом, существует три полных раунда Randoм мутагенеза следует перетасовка ДНК в результате бактериолитический молекулы с развивались термическое поведение. Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 2. 96-луночный планшет шаблоны для направленной эволюции анализа. Схемы планшет при определении оптимальных условий нагрева (рис. 2) состоит из одной прививки родительских WT PlyC клон в каждой строке планшет. Схема планшет во время скрининга мутантов (рис. 2, б) состоит из прививки каждую лунку в столбце 1 с уникальной родительских WT PlyC клона, а также прививки каждой лунки в колонках 2-12 с различными PlyC мутантных клонов. Wells A1-D1 предназначены для положительного родительского контроля, которая совместноnsist из WT PlyC конструкций не подвергается не-допустимой температуры инкубации. Wells E1-H1 предназначены для отрицательных родительского контроля, которые состоят из WT PlyC конструкций, которые подвергаются не-допустимой температуры инкубации. Рисунок 3. Остаточная активность кинетического анализа сравнения WT PlyC и 29C3. Ферменты очищают до однородности и инкубировали в течение 30 мин в амплификатор на равных молярных концентрациях на любом комнатной температуре или при градиент температуры от 45-50 ° C. Ферментативная активность коррелирует с максимальной скоростью отображается после конкретного температуры инкубации. За исключением 25 ° C и 47,7 ° C, изменения в активности между WT и 29C3 при каждой температуре коррелирует с р-значение <0,05. Все данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. </p> Рисунок 4. Остаточная активность кинетического анализа сравнения WT PlyC к 29C3 при температуре 35 ° C и 40 ° C. равных молярных концентрациях очищенного WT PlyC и 29C3 инкубировали в нагревательный блок при температуре 35 ° С (рис. 4а) или 40 ° С (рис. 4б). Остаточная активность фермента была измерена в 24 и 48 очков час времени. Деятельность отображаются каждой конструкции были нормированы на максимальную скорость отображается в нулевой момент времени точка. Различия в активности между WT и 29C3 в каждой точке температуры и времени коррелирует с р-значение <0,05. Все данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. Рисунок 5. Остаточная активность кинетического анализа сравненияWT PlyC к 29C3 при 45 ° C. равных молярных концентрациях очищенного WT PlyC и 29C3 инкубировали в нагревательный блок при 45 ° С и остаточной активности фермента измеряли каждые 20 мин в течение 3 часов. Деятельность отображаются каждой конструкции были нормированы на максимальную скорость отображается в нулевой момент времени точка. За исключением точек данных на 20 мин, изменения в активности между WT и 29C3 в каждый момент времени коррелирует с р-значение <0,05. Все данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов.

Discussion

Этот протокол, указаны на рисунке 1, представляет собой 96-луночные методологии пластины микротитровальных, что позволяет использовать направленной эволюции для увеличения термостойкости любой бактериолитический фермента. Благодаря использованию ошибок ДНК-полимеразы, можно ввести случайных мутаций, которые увеличивают общую кинетическую стабильность в переводе бактериолитический интерес молекулы, которые, как правило, за счет молекулярного реорганизаций, состоящий из увеличения электростатического, дисульфида моста и гидрофобных взаимодействий, которые генерируют улучшилось упаковки молекул, расширенные модификации поверхностного заряда сетях или усиление выше олигомеризации состоянии 17-18. После введения нуклеотидных мутаций, обширные процедуры скрининга затем был использован для выявления мутаций, которые являются термически полезно. Представитель результаты, представленные здесь, были основаны на один раунд случайного мутагенеза. На самом деле, было высказано предположение, чтопо крайней мере, трех последовательных раундов случайного мутагенеза, каждый из которых использует самые надежные мутанта в качестве ведущего фермента, после перетасовки ДНК подходит для этих типов направленной эволюции тепловых исследований поведения 2.

Важно понимать, что в то время как этот протокол определяет мутации, которые увеличивают кинетическую стабильность, эти варианты не обязательно возросла термостабильность. Молекула считается термостабильные, когда оно имеет способность сохранять свою структуру при высокой температуре. Тем не менее, в анализе представлены, остаточная активность мутантного лизатов не анализировали при той же температуре, что они были первоначально инкубировали в течение стадии термообработки и, следовательно, не может быть выбора для мутаций, которые способствуют рефолдинг, а не расширение термостабильность 19. Пока мы экстраполяции термическое поведение как признак термической стабильностью, правда термической стабильности должна быть измерена эмпирическим путем Biophysческих методов, таких как кругового дихроизма (КД), дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) и дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). Предварительные данные с компакт-диска и DSF эксперименты показывают, что несколько кандидатов, выявленных в методологии, представленной действительно отображения прогресса термостабильность (данные не показаны).

Хотя методика, представленная здесь, характерных для реализации повышенной тепловой поведение PlyC, эта же методика может быть дополнительно использованы для повышения тепловой активности других ферментов бактериолитический с некоторыми незначительными изменениями переменных, таких как буфер, частота мутаций, отопление условий и выражений системы. Одним из наиболее важных переменных, связанных с этим анализом относится к нуклеотидной скорость мутации ошибок ДНК-полимеразы. Мы решили использовать ошибок Mutazyme ДНК-полимеразы II в нашем направленной эволюции анализа в связи с экспериментальных доказательств того, данный фермент отображает наименьшее количество смещения сотношении которых нуклеотиды случайно включен в интересующего гена по сравнению с другими случайными методами мутагенеза, такие как использование гидроксиламина, мутатор E. штаммов и других ошибок ДНК polyermases 20. В целом, снижение ставок мутации имеют тенденцию быть более желательным по двум причинам. Во-первых, инженерно термостабильность с белками, как правило, состоит из сравнительно небольшого числа аминокислотных замен. Высокие темпы мутация может привести к серьезным структурным изменениям в частности молекул, которые могут окончательно привести к структурным и функциональным неправильного сворачивания расхождения. Например, включение глицина и пролина может нарушить альфа-винтовой вторичной структуры 21. Во-вторых, высокие цены нуклеотидных мутаций увеличить шансы на включение преждевременного стоп-кодона, в результате усеченный молекул, которые являются биологически неактивными. В целом, снижение ставок мутации являются предпочтительными, поскольку нижние частоты появления ошибок в результате АккумуляторыATION адаптивных мутаций в то время как более высокие темпы мутаций создания нейтральной или вредных мутаций 22.

Для каждого раунда случайного мутагенеза, еще одна важная переменная, что надо оптимизировать включает в себя температуру инкубации использованы в процессе скрининга. Выбор экспериментальных без разрешительных температура относительно сложной задачей. Мы изначально использовали температуру инкубации, которая была 10 ° C выше, чем без разрешительных температура PlyC, однако после скрининга 3000 мутантами, мы не смогли выявить любые выгодные мутации. Имея в виду, направленная эволюция методологии состоит из последовательного выявления полезных аминокислотных замен, которые имеют аддитивный эффект, было установлено, что менее строгие температура должна быть использована в процессе скрининга, даже если она увеличилась вероятность генерации ложных срабатываний. Таким образом, мы использовали температуру инкубации, который был всего на несколько градусов выше, не допустIve температуры и повторный скрининг отобранных кандидатов для исключения ложных срабатываний.

Мы решили использовать температуру инкубации который не был слишком умеренным (≤ 1 ° C выше, чем низкие, не разрешительный температуры) и, наоборот, не слишком жесткие (≥ 5 ° C выше, чем низкие, не разрешительный температуры). Идеальная температура мы решили использовать в данном анализе была умеренной 2 ° C выше, чем экспериментально определяется не-допустимой температуре. Выбор температуры, которая является слишком мягким приведет к гораздо более высокий процент ложных срабатываний идентификации, чем ~ 20% наблюдалось (табл. I) при использовании умеренной температуры инкубации. Кроме того, использование температуры инкубации, которая является слишком суровым в конечном счете может привести к невозможности определить мутантов со значительно повышенной термической поведения. Например, с помощью инкубации температура ≥ 5 ° C привело бы к невозможности определитьперспективные 29C3 мутант, а также большинство других кандидатов, отобранных в первом туре отбора.

Подводя итог, мы предоставляем протокол для инженерных бактериолитических ферментов приобрести расширенные кинетической стабильности. Кроме того, этот же анализ, без отопления шаги, может быть использована для выявления мутаций, которые увеличивают каталитическую активность. Дополняя как каталитическая активность и термостабильность является важным препятствием развития, стоящих перед любым терапевтическим фермента. Хотя детали этого протокола являются специфическими для лейкин PlyC, методика может быть адаптирована к любым бактериолитический фермента только с несколькими изменениями. Мы представили предварительные результаты только первого раунда мутагенеза, который подтверждает, что функциональные возможности анализа, в результате реализации и идентификации мутаций, которые генерируют увеличение молекулярной термостабильность значительной величины.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Эмилия Renke и Джанет Ю. технической помощи. DCN при поддержке грантов от Министерства обороны США (DR080205, DM102823, OR09055, и OR090059). RDH при поддержке гранта от эксперимента Мэриленд сельского хозяйства железнодорожного вокзала и грантов NIH Обучение в клеточной и молекулярной биологии.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78260
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit Agilent Technologies 200500
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid BD Vacutainer Labware Medical 353072
96 Well Nonskirted PCR Plates Fisher Scientific 14-230-232
Swing-bucket Rotor Eppendorf A-2-DWP
Ampicillin Sodium Salt Fisher Scientific BP1760
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904
Arabinose Fisher Scientific BP2504
pBAD24 Expression Vector ATCC 87399
pBAD33 Expression Vector ATCC 87402
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
  2. Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
  3. Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
  4. Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
  5. Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins–current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
  6. Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
  7. Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
  8. Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
  9. Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
  10. Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
  11. Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
  12. Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
  13. Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
  14. McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
  15. Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
  16. Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
  17. Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
  18. Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
  19. Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
  20. Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
  21. Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
  22. Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).

Tags

Directed EvolutionThermostable Bacteriolytic EnzymesScreening MethodMolecular EngineeringProtein PropertiesRational-based ApproachesVariantsStructural StabilityEndolysinsBacteriophagePeptidoglycanCell WallLysisPlyC EndolysinPlyCA SubunitPlyCB SubunitGroup A Streptococci (GAS)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Heselpoth, R. D., Nelson, D. C. A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes. J. Vis. Exp. (69), e4216, doi:10.3791/4216 (2012).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image