耐熱性工学の分野に特有の新奇向進化法は溶菌酵素のために開発され、結果的に検証されました。高温のインキュベーションの後、野生型タンパク質と比較した場合、ランダム突然変異誘発の唯一の1ラウンドの後、進化した溶菌酵素、PlyC 29C3は、二回残存活性よりも大きく表示されます。
向進化は自然の中でタンパク質に関連付けられていない特定のプロパティを取得するためにタンパク質を設計するために自然淘汰を活用するためのメソッドとして定義されます。文学は正常分子特異性と触媒1を変更するために定向進化の実施について多数の例を提供してきました。分子工学のための指向性進化の代わりに、より合理的なベースのアプローチを利用する主な利点は、2をスクリーニングすることができる変異体の量と多様性に関連する。定向進化の一つの可能なアプリケーションは、エンドリシンとして溶菌酵素の構造安定性を改善することを含む。エンコードと子孫ビリオンの宿主細胞の溶解および解放の結果、細菌のペプチドグリカン( すなわち細胞壁)における重要な共有結合を加水分解するエンドリシンを表現するバクテリオファージ。特筆すべきは、これらの酵素は、外因susceptする溶解を誘導する能力を有し、ible細菌ファージの不存在下で、さらには、in vitroおよびそれらの治療法としての可能性3-5 in vivoの両方で検証されています。私たちの指向性進化の研究の主題はPlyCAとPlyCBサブユニット6から構成されているPlyCエンドリシンを伴う。精製し、外因性添加する場合には、PlyCホロ酵素は、ほんの数秒で群レンサ球菌(GAS)だけでなく、他の連鎖球菌グループを溶解し、さらにガス7に対するin vivoで検証されています。かなり、高温のインキュベーション後の残留酵素反応速度を監視することPlyCこの酵素の追加開発が制限される場合があります短い治療の貯蔵寿命を、示唆し、45℃で急激に溶解活性を失うという明確な証拠を提供しています。さらなる研究がPlyCBサブユニットが安定しているのに対し、熱安定性の欠如が唯一PlyCAサブユニットで観察されるまで明らか〜90℃(未発表データ)。 PlyCに加えて、sがあるエンドリシンの熱に不安定な性質を記述する文献でエベラル例。例えば、 黄色ブドウ球菌エンドリシンLysKと肺炎球菌エンドリシンCPL-1とパルは42で自発的に活性を失う℃、43.5℃、50.2℃、それぞれ8月10日 。特定のシステムに存在する温度に、化学反応の速度を関連付けるアレニウスの式によると、熱安定性の増加は、棚の平均余命11の増加と相関する。この目的に向かって、監督の進化は自然の中で様々な分子の熱活性を変化させるための有用なツールであることが示されているが、この特定の技術は、溶菌酵素の研究のためにこの脆弱性を悪用されていませんでした。同様に、抗菌剤のこの特定のクラスの構造的安定性を進行することの成功したアカウントが完全に存在しないに等しい。このビデオでは、エラー-prを使って斬新な手法を採用する1 DNAポリメラーゼ酵素動力学的安定性の増加( 図1)に相関PlyCレンサ球菌エンドリシンのPlyCAサブユニットに変異を同定するために、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットを使用して最適化されたスクリーニングプロセスが続く。ランダム突然変異誘発のちょうど1ラウンド後の結果は、方法論は、高温処理後に野生型(WT)PlyCと比較すると倍以上の残存活性を保持PlyC変異体を生成することが示唆された。
図1に概説このプロトコルは、1は、任意の溶菌酵素の熱安定性を高めるために定向進化を利用することを可能にする96ウェルマイクロタイタープレートの方法論を提示する。エラーが発生しやすいDNAポリメラーゼを使用することにより、人は、ジスルフィド架橋、改善生成する疎水性相互作用を一般的に静増加から成る分子の再編によるもので興味のある翻訳溶菌分子全体の運動の安定性を増加させるランダム変異を導入することができます分子充填、表面電荷ネットワークまたはより高いオリゴマー形成状態17から18の補強の強化改造。塩基変異の導入後、広範なスクリーニング方法は、その後、熱的に有益な変異を同定するために使用された。ここで紹介する代表的な結果は、ランダム突然変異誘発の1ラウンドに基づいていた。現実には、それがあることが示唆されているDNAシャッフリング続いランダム突然変異の少なくとも3つの連続したラウンド、鉛酵素として最も堅牢な変異体を用いて各々は、定向進化熱挙動の研究、これらのタイプ2に適しています。
このプロトコルは動力学的安定性を増大させる変異を特定しますが、これらの変異体は必ずしも増加した熱安定性を持っていないことを理解することが重要です。それは高温で、その構造を保持する能力を持っているときに分子が熱安定性と見なされます。しかし、提示されたアッセイでは、変異体溶解液の残存活性は、彼らが最初に熱処理工程中でインキュベートしたので、一つは19フォールディングではなく、強化された熱安定性を促進する変異を選択することができるのと同じ温度でアッセイされていません。我々は、熱安定性の指標として、熱挙動を外挿すれていますが、真の熱安定性は生物物理学によって経験的に測定する必要がありますこのような円偏光二色性(CD)、示差走査熱量測定(DSC)および示差走査蛍光定量(DSF)としてiCALメソッド。 CDやDSFの実験から予備的なデータは提示方法論から同定されたいくつかの候補が実際に進行した熱安定性を(データは示されていない)が表示されないことを示唆している。
ここで紹介する方法はPlyCに増加し熱挙動を実装するための固有のものですが、これと同じ方法は、さらに、例えば、緩衝液、突然変異率、加熱条件および発現系などの変数にいくつかのマイナーな変更を加えて他の溶菌酵素に熱活性を増強するために用いることができる。このアッセイに関連する一つの重要な変数は、エラーを起こしやすいDNAポリメラーゼのヌクレオチド変異率に関するものである。我々は、この特定の酵素を示唆する実験的証拠に起因する当社の定向進化アッセイでエラーが発生しやすいMutazyme II DNAポリメラーゼが持つバイアスの最低額を表示し使用することにしましたヌクレオチドは無作為にそのようなヒドロキシルアミン、ミューテータEの使用など、他のランダムな突然変異誘発技術と比較して、目的の遺伝子に組み込まれているに関して大腸菌株および他のエラーが発生しやすいのDNA polyermases 20。一般的に、低い突然変異率は二つの理由からより望ましい傾向にある。まず、タンパク質へのエンジニアリング熱安定性は、典型的には、比較的少数のアミノ酸置換で構成されています。高い突然変異率が決定的に構造上のミスフォールディングおよび機能的相違をもたらすことができ、特定の分子への劇的な構造変化を引き起こす可能性があります。例えば、グリシン、プロリン残基を組み込むことは、αヘリックス二次構造21を混乱させることができます。第二に、高い塩基変異率は、生物学的に不活性である分子を切り捨て、その結果、早期停止コドンを組み込むことの可能性を高める。一般的に、低い突然変異率が好ましいためaccumulの低いエラー率の結果適応変異のationより高い突然変異率が中立または有害な突然変異22を生成しながら。
ランダム突然変異誘発のラウンドごとに、1が最適化しなければならないもう一つの重要な変数は、スクリーニングプロセス中に使用されるインキュベーション温度を必要とする。実験的な非許容温度の選択は比較的困難である。我々は、最初に10歳の培養温度を用い℃、PlyCの非許容温度よりも高いしかし3000変異株をスクリーニングした後、我々がどんな有利な変異を同定することができませんでした。定向進化の方法論を順次添加剤の効果を持っている有益なアミノ酸置換を識別で構成されて念頭に置いて、それは偽陽性を生成できる可能性が増加した場合であってもそれほど厳しく温度はスクリーニングプロセス中に使用されるべきであることを決定した。このように、我々は唯一の非permiss上記数度あったインキュベーション温度を使用アイブ温度と再スクリーニングし、選択した候補者は、偽陽性を除外する。
我々はあまりにも温帯ではありませんでした(≤1℃最低非許容温度よりも高い)、逆にあまりにも過酷ではない(≥最低非許容温度より5℃以上)培養温度を利用することを決めた。我々は、この特定のアッセイで使用することを決めた理想的な温度は適度な2℃で実験的に決定され、非許容温度よりも高い。適度なインキュベーション温度を使用するときにあまりにも軽度である温度を選択することは、我々が観察した約20%( 表I)よりもはるかに高い偽陽性識別率になります。さらに、あまりにも過酷である培養温度を用いて、最終的には大幅に強化された熱挙動と突然変異体を同定することができないことにつながる可能性があります。例えば、≥5の培養温度を用い℃で識別することができないことに終わっていただろう有望29C3変異ならびにスクリーニングの最初のラウンド中に選択した他の候補者の大半。
合計では、強化された運動安定性を獲得するためのエンジニアリング溶菌酵素のためのプロトコルを提供する。また、この同じアッセイは、加熱処理を行わない場合、触媒活性を向上させる変異をスクリーニングするために使用することができます。触媒活性と熱安定性の両方を増強しても、治療の酵素が直面している重要な発達のハードルである。このプロトコルの詳細はエンドリシンPlyCを特定できますが、方法論はわずかな変化を持つ任意の溶菌酵素に適合させることができます。私たちはかなりの大きさの分子の熱安定性の増加を生成する変異の実装と同定、その結果、アッセイのその機能を検証突然変異誘発の最初のラウンドからの予備結果を発表した。
The authors have nothing to disclose.
著者は、技術支援のためにEmilija Renkeとジャネットゆうに感謝したいと思います。 DCNは、米国国防総省(DR080205、DM102823、OR09055、そしてOR090059)からの助成金によってサポートされています。 RDHは、メリーランド州農業試験場及び細胞分子生物学におけるNIHの訓練助成金からの助成金によってサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |