耐高温溶菌酶的定向进化的一个新的筛选方法

1。确定加热条件首先，必须通过实验确定最佳的温育温度和时间，在测定中使用的加热步骤。对于我们的PlyC模型，重要的是要注意， 大肠杆菌大肠杆菌对单独的表达质粒共转化与plyCA和plyCB基因已被证明，以形成一个全功能的PlyC全酶6。适于从在文献中提供的实施例12-16的96孔微量滴定板的制备以及作为细胞生长条件和随后副本电镀技术。从以前的热灭活实验的结果决定活动急剧下降，在短期在超过生理温度（未发表的观察）的环境中孵化，孵化时间30分钟将适合此法。的最佳培养温度为PlyC阐明通过下面的步骤： 陈德良sform表达构建pBAD24：plyCA（安培）到主管E.大肠杆菌菌株DH5αpBAD33：plyCB（CM）。 板上的Luria-Bertani（LB）补充氨苄青霉素（100微克/毫升）和氯霉素（35微克/毫升）的琼脂平板上的转化体。一夜之间孵育板在37°C。 用无菌牙签，单个菌落接种到每个排孔（ 图2a）中的无菌的，清晰的，平底96孔，带盖的微量滴定板，其中包含200微升补充有氨苄青霉素和氯霉素的LB。 可以安全地放置在96孔微量滴定板在37℃下摇床和长出的细菌在300rpm过夜。 找回的96孔微量滴定板的37℃下摇床和副本板到一个新的96孔微量滴定板，如下所示： 加入180μl辅以氨苄青霉素和氯霉素的LB副本板的各孔。 从原版20μl的细菌转移到相应的井在副本板。这将导致在初始OD 600为〜0.5。 安全地将副本板在37度，Ç颤抖的孵化器和孵化1小时，在300转板，然后添加inductant。在PBAD表达系统的情况下，inductant是0.25％阿拉伯糖。其他表达系统可能需要不同的inductants。板放置在37℃下摇床和摇一个额外的4小时，以允许用于蛋白质表达在300rpm。表达水平通常介于10-20微克的PlyC的。 一旦蛋白的表达已经结束，检索的副本板和颗粒的细菌在冷冻离心机，包含摆动斗转子，适合96孔酶标板96孔酶标板。在3,000 rpm下离心10分钟，在室温下。慢慢地翻转酶标板取出介质上清，轻轻地调迁的媒体。 向每孔加入50μl的第二B-PER细菌蛋白抽提试剂溶解细胞。板在室温下孵育20分钟。 增大音量，在各孔中，通过加入120微升70微升磷酸盐缓冲盐水（PBS），PH值7.2。 沉淀不溶的细胞碎片，通过纺丝板以3,000 rpm，在冷冻离心机在4℃下10分钟。 水溶性粗提液110微升转移到一个96孔的热循环仪板相应的孔中。 使用预定的孵化时间为30分钟，暴露的可溶性裂解目前居住在96个热循环仪板了广阔的梯度温度范围15-20℃。注意，目标是要确定在什么温度下一个特定的酶失去了> 95％的催化活性。 孵化，孵化后的96孔温度循环器板在4℃下5分钟，从96孔的热循环仪板100微升的可溶性裂解物转移到其相应的在最后的96孔微量滴定板的井位。 随着一个12通道multipipettor，每孔加入100μl的GAS菌株D471。请注意，D471的细胞原本是从过夜培养冻干并重新悬浮用PBS pH值7.2〜2.0，得到的OD 600。 立即放置在96孔板上，在微孔板分光光度计和通过测量的OD 600为20分钟，每15秒监测的酶动力学。被定义为在非允许温度下，对应于井，缺乏光密度的变化（ΔOD≤0.1）的最低温度孵育。 一个宽的温度屏幕之后执行，以确定非允许温度下，可以重复上述步骤，在一个更​​窄的范围内的温度（5℃-10℃），以澄清感兴趣的酶的精确的非允许温度下。请注意，非允许温度下，在该测定中确定比通过其他方式阐明的熔融温度可能会有所不同，由于体积差异，浓度等 2。生成的突变体库以进行筛选的突变体库的创建涉及随机纳入由以最小的核苷酸偏压在plyCA基因，使用如下的GeneMorph II随机诱变试剂盒的一个容易出错的DNA聚合酶的突变： 设计相似的熔融温度（Tm）的55-72℃下与给出的限制性位点的5'和3'末端的plyCA基因之间的核苷酸引物。 由于所需的突变率是2-3核苷酸每plyCA的 （1.4kb的），使用PCR反应组分的浓度，以及低的突变f由生产商推荐的条件的热循环仪requencies（0-4.5每KB）。 的的诱变plyCA基因克隆到表达载体pBAD24。 变换的的构造成DH5αpBAD33：plyCB背景和板补充与氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板上的转化体。 此外，变换和板DH5αpBAD33：plyCB pBAD24含有的WT plyCA基因的表达载体。从这个板块的殖民地将作为筛选过程的控制。 3。 96孔微孔板的制备及细胞生长条件填充在96孔微量滴定板的各孔中，用200μl补充有氨苄青霉素和氯霉素的LB。 微量滴定板的原理图（ 图2b）之后，小心地从过夜的琼脂平皿上选择一个单独的菌落用无菌牙签和接种的细菌，在指定的96孔微量滴定解放军德。这是必要的，以确保只有一个殖民地，每孔接种。 摇动牢固地固定的96孔微量滴定板在37℃下在300 rpm的转速下过夜 4。副本电镀，蛋白表达的诱导和裂解液的制备按照步骤1.5-1.11一节“确定最佳的加热条件”的一个修改。存储的原始板，在4℃下后的副本电镀步骤已经结束。 步后1.11，转移除了阳性对照孔A1-D1的96孔的热循环仪板的相应孔中的可溶性的粗裂解物到110微升。关于与阳性对照溶胞产物（ 即裂解物，不加热），转移到相应的井在一个新的96孔微量滴定板，将作为最终测定板的实验和存储在冰上的溶胞产物的100μl的。 5。可溶性细胞裂解液热处理热阴性对照和突变体可溶性裂解液目前只限于在步骤1中确定在优化非许可孵化温度为30分钟，在热循环仪96孔热循环仪板。 非允许温度下温育后，在4℃下孵育96以及热循环仪板5分钟。 将100微升的可溶性裂解物从96孔的热循环仪的板，其在最后的96孔微量滴定测定板已经含有可溶性裂解物的阳性对照相同的井位。 随着一个12通道multipipettor，每孔加入100μl的GAS菌株D471。在微孔板分光光度计立即将板。 监视的酶动力学通过测量OD 600每15秒20分钟。 甲PlyC与进展的热行为的变体被定义为一个结构中，可降低50％原来的光学密度在少于900秒，在该非允许温度。此外，阳性对照（ 即非加热，WT PlyC）需要以显示WT的催化活性（ 的t 1/2≤100秒）和阴性对照（ 即加热，WT PlyC）应该是没有活性的。 一旦PlyC变种与进展热行为被识别，检索储存在4℃和接种细菌从个人以及特定的突变成与氨苄青霉素和氯霉素的新鲜LB培养基中的兴趣的原始板。过夜生长的接种物，在37°C。 从文化的提取和纯化质粒DNA，然后进行测序，以确定的核苷酸突变，推测增强的热性能PlyCA提交。此外，补充从过夜培养的小等分试样用10％甘油和存储在-80℃下以供进一步使用。