A طريقة الفرز الجديد للمن التطور الموجه للجراثيم الانزيمات بالحرارة
Summary
وقد وضعت رواية الأسلوب التطور الموجه محددة لمجال الهندسة صمود للحرارة وبالتالي التحقق من صحة لالإنزيمات للجراثيم. فقط بعد جولة واحدة من الطفرات العشوائية، وهو الانزيم تطورت للجراثيم، PlyC 29C3، عرض أكبر من النشاط المتبقية مرتين بالمقارنة مع البروتين من النوع البري بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة.
Abstract
ويعرف التطور الموجه كوسيلة لتسخير الانتقاء الطبيعي من أجل هندسة البروتينات للحصول على خصائص خاصة التي لا ترتبط مع البروتين في الطبيعة. وقد وفرت الأدب أمثلة عديدة فيما يتعلق بتنفيذ التطور الموجه لتغيير بنجاح خصوصية الجزيئية والحفز 1. والميزة الرئيسية لاستخدام التطور الموجه بدلا من اتباع نهج أكثر عقلانية على أساس الهندسة الجزيئية لليتصل حجم وتنوع المتغيرات التي يمكن فحص 2. طلب واحد ممكن من التطور الموجه ينطوي تحسين الاستقرار الهيكلي للجراثيم من الإنزيمات، مثل endolysins. عاثية ترميز والتعبير عن endolysins لهيدروليزي السندات التساهمية الحرجة في ببتيدوغليكان (أي جدار الخلية) من البكتيريا، مما يؤدي إلى تحلل الخلايا المضيفة والتحرر من virions ذرية. والجدير بالذكر أن هذه الانزيمات تمتلك القدرة على إحداث تحلل خارجيا لsusceptوقد تم التحقق من صحة البكتيريا ible في غياب بالعاثية وعلاوة على ذلك سواء في التجارب المختبرية والحية لقدرتها العلاجية 3-5. موضوع دراستنا التطور الموجه ينطوي على حالة جوانية PlyC، التي تتألف من الوحدات الصغرى وPlyCA PlyCB 6. بعد تنقيته وأضاف خارجيا، وعميم الإنزيم PlyC lyses مجموعة العقديات A (GAS) وكذلك الجماعات العقدية الأخرى في غضون ثوان، وعلاوة على ذلك تم التحقق من صحة في الجسم الحي ضد GAS 7. بشكل كبير، ورصد حركية إنزيم المتبقية بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة يقدم دليلا المتميزة التي PlyC يفقد النشاط التحللي فجأة في C ° 45، مما يشير إلى مدة الصلاحية القصيرة العلاجية، والتي قد تحد من التنمية إضافية من هذا الانزيم. مزيد من الدراسات تكشف لوحظ فقط عدم وجود الاستقرار الحراري للالوحيدات PlyCA، في حين أن الوحيدات PlyCB مستقرة تصل إلى ~ 90 ° C (المراقبة غير منشورة). بالإضافة إلى PlyC، وهناك لياليeveral الأمثلة في الأدب التي تصف طبيعة بالحرارة من endolysins. على سبيل المثال، المكورات العنقودية الذهبية حالة جوانية LysK والعقدية الرئوية endolysins العريف-1 ويفقد بال النشاط بصورة عفوية في 42 ° C، 43.5 ° C و 50.2 ° C، على التوالي 8-10. وفقا للمعادلة أرينيوس، والتي تتعلق في سرعة التفاعل الكيميائي حتى الوقت الحاضر درجة الحرارة في نظام معين، وزيادة في صمود للحرارة ترتبط بزيادة في متوسط العمر الافتراضي 11. ولتحقيق هذه الغاية، وقد تبين التطور الموجه ليكون أداة مفيدة لتغيير النشاط الحراري للجزيئات مختلفة في الطبيعة، ولكن لم يحدث قط أن هذه التكنولوجيا قد نجح في استغلال خاصة لدراسة الإنزيمات للجراثيم. وبالمثل، حسابات الناجح لتتقدم على الاستقرار الهيكلي من هذه فئة معينة من مضادات الميكروبات هي تماما غير موجود. في هذا الفيديو، ونحن توظيف منهجية الرواية التي تستخدم خطأ للعلاقات العامة1 البلمرة DNA يليها عملية الفرز الأمثل باستخدام لوحة عيار مكروي أن 96 جيد التنسيق لتحديد الطفرات إلى الوحيدات PlyCA من حالة جوانية العقدية التي ترتبط PlyC إلى زيادة الاستقرار الحركي انزيم (الشكل 1). نتائج الجولة بعد واحد فقط من الطفرات العشوائية تشير إلى منهجية تولد المتغيرات التي تحتفظ PlyC أكثر من ضعف النشاط المتبقية بالمقارنة مع PlyC (WT) من النوع البري بعد العلاج درجة حرارة مرتفعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول، المبينة في الشكل 1، ويعرض أن 96 لوحة جيدا عيار مكروي المنهجية التي يسمح احد للاستفادة من التطور الموجه لزيادة صمود للحرارة من أي جراثيم الانزيم. من خلال استخدام الحمض النووي لبوليميراز عرضة للخطأ، يمكن للمرء أن أعرض الطفرات العشوائية التي تزيد من الاستقرار العام الحركية للجزيء للجراثيم مترجمة من الفائدة، وهو عادة بسبب عمليات إعادة التنظيم الجزيئي التي تتكون من زيادة كهرباء، ثاني كبريتيد الجسر والتفاعلات التي تولد مسعور تحسين الجزيئية التعبئة، وتعزيز شبكات التعديلات الشحنة السطحية أو تعزيز حالة ارتفاع oligomerization 17-18. بعد إدخال طفرات النوكليوتيدات، ثم تم استخدام إجراء فحص واسعة النطاق لتحديد الطفرات التي تعود بالفائدة حراريا. واستندت النتائج على ممثل المقدمة هنا جولة واحدة من الطفرات العشوائية. في الواقع، وقد اقترح أنعلى الأقل ثلاث جولات متتالية من الطفرات العشوائية، باستخدام كل متحولة أقوى والانزيم الرصاص، تليها خلط الحمض النووي هو مناسبة لهذه الأنواع من الدراسات الموجهة تطور السلوك الحراري 2.
من المهم أن نفهم أنه في حين أن هذا البروتوكول يحدد الطفرات التي تزيد الاستقرار الحركي، لا هذه المتغيرات بالضرورة زادت صمود للحرارة. ويعتبر جزيء بالحرارة عندما يكون لديه القدرة على الاحتفاظ هيكلها عند درجة حرارة عالية. ومع ذلك، في مقايسة المقدمة، لا يعاير النشاط المتبقية لللست] متحولة في نفس درجة الحرارة التي حضنت في البداية أنها في أثناء العلاج الحرارة خطوة وبالتالي يمكن للمرء أن يكون اختيار الطفرات التي لتعزيز صمود للحرارة طوي ثانية بدلا من تعزيز 19. بينما نحن استقراء السلوك الحراري مؤشرا على الاستقرار الحراري، يجب أن تقاس الاستقرار الحراري صحيح تجريبيا بواسطة biophysطرق كال مثل ازدواج اللون دائرية (CD)، الفرق الكالوري المسح الضوئي (DSC) والفرق fluorimetry المسح (DSF). البيانات الأولية من التجارب CD مهرجان دبي للتسوق وتشير إلى أن العديد من المرشحين من تحديد المنهجية المقدمة لا تقدم عرض الواقع صمود للحرارة (لا تظهر البيانات).
على الرغم من أن المنهجية المقدمة هنا هي محددة لتنفيذ السلوك الحراري لزيادة PlyC يمكن، بالإضافة إلى ذلك نفس هذه المنهجية أن تستخدم لتعزيز نشاط الانزيمات الحرارية لجراثيم أخرى مع بعض التعديلات الطفيفة على متغيرات مثل المخازن المؤقتة، ومعدلات الطفرات، والظروف أنظمة التدفئة والتعبير. متغير واحد الحرجة المرتبطة بهذا الفحص يتصل معدل الطفرة النوكليوتيدات من البلمرة DNA عرضة للخطأ. اخترنا لاستخدام عرضة للخطأ DNA بوليميراز الثاني Mutazyme في مقايسة لدينا التطور الموجه بسبب الأدلة التجريبية تشير هذا الانزيم خاص يعرض أقل قدر من التحيز معوتدرج بشكل عشوائي يتعلق النيوكليوتيدات التي في الجينات ذات الاهتمام بالمقارنة مع غيرها من تقنيات الطفرات العشوائية مثل استخدام هيدروكسيل، mutator E. سلالات القولونية وغيرها من DNA عرضة للخطأ polyermases 20. بشكل عام، وانخفاض معدلات طفرة تميل إلى أن تكون أكثر من المرغوب فيه لسببين. أولا، صمود للحرارة الهندسية للبروتينات تتكون عادة من عدد قليل نسبيا من بدائل الأحماض الأمينية. يمكن أن يسبب ارتفاع معدلات طفرة هائلة التغييرات الهيكلية لجزيئات معينة التي يمكن أن تؤدي بشكل قاطع في misfolding التناقضات الهيكلية والوظيفية. على سبيل المثال، يمكن دمج جليكاين وبقايا البرولين تعطيل هياكل حلزونية ألفا الثانوية 21. ، وارتفاع معدلات الطفرة النوكليوتيدات الثاني يزيد من فرص دمج المبكرة الكودونات توقف، مما أدى إلى اقتطاع الجزيئات التي هي غير نشطة بيولوجيا. بشكل عام، ويفضل انخفاض أسعار طفرة بسبب انخفاض معدلات نتيجة خطأ في بطاريات لأوجه من الطفرات على التكيف مع ارتفاع معدلات توليد الطفرات طفرة محايدة أو ضارة 22.
لكل جولة من الطفرات العشوائية، وآخر متغير الحرجة التي يجب على المرء أن تحسين ينطوي على درجة حرارة الحضانة المستخدمة أثناء عملية الفرز. اختيار درجة الحرارة غير متساهلة نسبيا التجريبية يمثل تحديا. كنا في البداية درجة حرارة الحضانة التي كانت 10 ° C أعلى من درجة حرارة غير متساهل من PlyC، ولكن بعد فحص 3000 المسوخ، لم نتمكن من تحديد أي الطفرات المفيدة. مع الأخذ في الاعتبار منهجيات التطور الموجه تتكون من تحديد بدائل مفيدة بشكل تسلسلي الأحماض الأمينية التي لها آثار المضافة، تقرر أنه ينبغي استخدام درجة حرارة أقل صرامة خلال عملية الفرز حتى لو كان زيادة الفرصة لتوليد ايجابيات كاذبة. على هذا النحو، استخدمنا درجة حرارة الحضانة الذي كان فقط بضع درجات فوق permiss غيرإيف درجة الحرارة والمرشحين المختارين rescreened استبعاد ايجابيات كاذبة.
قررنا استخدام درجة حرارة الحضانة لم يكن المعتدلة جدا (≤ 1 ° C أدنى درجة حرارة أعلى من غير متساهل) والعكس ليس قاسيا جدا (≥ 5 ° C أدنى درجة حرارة أعلى من غير متساهل). كانت درجة الحرارة المثالية قررنا استخدامها في هذا الاختبار خاص (أ) 2 ° C معتدل درجة الحرارة أعلى من غير متساهل تحديد تجريبيا. واختيار درجة الحرارة التي هي خفيفة جدا يؤدي إلى معدل أعلى بكثير كاذبة تحديد إيجابية من 20٪ ~ احظنا (الجدول الأول) عند استخدام درجة حرارة معتدلة الحضانة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام درجة حرارة الحضانة التي هي قاسية جدا تؤدي في نهاية المطاف عدم القدرة على تحديد الطفرات مع السلوك الحراري المعزز بشكل ملحوظ. على سبيل المثال، باستخدام درجة حرارة حضانة ≥ 5 ° C قد أدت في عدم القدرة على تحديدوعد متحولة 29C3 فضلا عن غالبية المرشحين الآخرين المحددة أثناء الجولة الأولى من الفرز.
في الجمع، ونحن نقدم بروتوكول للجراثيم الانزيمات الهندسة للحصول على الاستقرار الحركية المحسنة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار نفسه، دون الخطوات التدفئة، للكشف عن الطفرات التي تزيد نشاط الحفاز. زيادة كل من صمود للحرارة ونشاط الحفاز يشكل عقبة هامة التنموية التي تواجه أي انزيم العلاجية. في حين أن تفاصيل هذا البروتوكول هي محددة إلى حالة جوانية PlyC، يمكن تكييف منهجية لأي إنزيم للجراثيم مع بعض التعديلات قليلة فقط. قدمنا النتائج الأولية من الجولة الأولى فقط من الطفرات من صحة هذه الوظيفة من الفحص، مما أدى إلى تنفيذ وتحديد الطفرات التي تولد زيادة في حجم الجزيئي للصمود للحرارة كبيرة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر Emilija Renke وجانيت يو للمساعدة التقنية. ويدعم DCN من المنح المقدمة من وزارة دفاع الولايات المتحدة (DR080205، DM102823، OR09055، وOR090059). ويدعم RDH بمنحة من التجربة ميريلاند محطة الزراعة ومنحة المعاهد الوطنية للصحة في التدريب الخلية والبيولوجيا الجزيئية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
Riferimenti
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins–current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
