Флуоресцентный<em> На месте</em> Гибридизации на митотических хромосом от комаров

1. Хромосома подготовка Личинки комаров было выращено с использованием стандартного протокола описаны в методах в Anopheles исследований доступна на сайте Научно-исследовательского малярией и справочники реагентов ресурсный центр (MR4) 13. Температура комаров воспитания были изменены, чтобы обеспечить высокое число хромосом в имагинальных дисков и низкая смертность личинок. Этапы развития личинок комаров были определены на основе размеров головы капсулы 13. Hatch комара яйца при температуре 28 ° С, а через 2-3 дня, передача 2-й или 3-го возраста личинки до 16 ° C для Ae. Aegypti и Cx. quinquefasciatus и до 22 ° С. gambiae. Место 4-го возраста личинок на льду в течение нескольких минут для иммобилизации. Передача личинки на слайд с капелькой холодного гипотонический раствор (0,5%, таксредой цитрат или 0,075 М хлористого калия), и поместить его под стерео микроскоп. Выберите личинки с овальной идентификаторов (рис. 1б) для дальнейшего расчленения. Обезглавьте личинки, и вырезать кутикулу с брюшной стороны личиночной грудной клетки использованием рассечение ножницами (рис. 2A). Сделать дополнительный разрез на второй или третий сегмент брюшка вскрыть кишечник от личинки. Направления разрезов показаны стрелками. Откройте кутикулу и удалите кишечника и жир от личинки. Снимите гипотонический раствор из слайд с использованием фильтровальной бумаги, а также добавить свежую каплю гипотонического раствора непосредственно к идентификаторов (рис. 2В). Хранить личинки в гипотонический раствор в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить гипотонического раствора с использованием фильтровальной бумаги, а также применять раствор Карнуа (этанол / уксусная кислота в соотношении 3:1). После добавления фиксирующие решение, IDS сразу становятся белыми и становятся хорошо видны под микроскопом (рис. 2C </sЧонг>). Использование рассекает иглы, удалить идентификаторы из личинки (рис. 2D), и передавать их в каплю 50% пропионовой кислоты. Удалите любые другие ткани, такие как кишечник и жира тела, от слайда. Крышка идентификаторы с unsiliconized 22×22 покровным, и держать в течение 10 минут при комнатной температуре. Накройте слайд с фильтровальной бумагой, и сквош ткани, нажав на ластик пучка по периметру крышки скольжения. Кратко проанализировать качество слайд, используя фазово-контрастного микроскопа 100x или 200x увеличением (рис. 3). Препараты с> 50 спреды хромосомы можно считать подходящим для рыбы. Опустите и удерживать слайд в жидком азоте до упора пузырьков. Снимите крышку от скольжения слайд, используя лезвие бритвы, и передать слайды сразу в контейнере из 70% этанола охлажденным до -20 ° C. Хранить при температуре 4 ° С в течение не менее 1 часа за лучший результат дегидратации (при необходимости, слайды можно хранить при тего шаге от нескольких минут до нескольких дней). Высушить слайды в серии этанола (70%, 80%, 100%) при 4 ° С в течение 5 мин каждая, и сухой воздух при комнатной температуре. Хранить сухую слайды при температуре от -20 ° C до использования их для рыбы. 2. Добыча Повторяющиеся Фракции ДНК Выполнение FISH ДНК-зонда BAC клона на хромосомы от Ae. Aegypti и Cx. quinquefasciatus требует использования немеченого повторяющихся фракции ДНК, чтобы заблокировать неспецифической гибридизации ДНК повторяется в хромосомах. Реассоциации одной нити ДНК раскололась на куски несколько сотен пар оснований следует C 0 т кривой, где C 0 является начальной концентрации одноцепочечной ДНК и Т reannealing времени. ДНК фракций с C0t значений, равных 10 -4 -10 -1 или 10 ° -10 2 рассматриваются как высоко и умеренно повторяющиеся, соответственно. Извлечение 400-500 мкг геномной ДНК из всего взрослого комара использованием Qiagen крови и Maxikit культуре клеток, и подготовить 100-1000 нг / мкл раствора ДНК в 1,2 x SSC. Денатурации ДНК путем размещения безопасной блокировки трубки с геномной ДНК в нагревательный блок, предварительно нагретой до 120 ° C в течение 2 мин. Высокая температура позволяет варьировать ДНК в 200-500 б.п. фрагментов. В зависимости от концентрации ДНК, реассоциировать ДНК путем размещения трубы при 60 ° С в течение 15-150 мин для получения C 0 фракций ДНК т до C 0 t3 (табл. 1). Поместите пробирку с ДНК на льду в течение 2 мин. Передача ДНК до 42 ° С, добавить предварительно нагретую 10x S1 нуклеазы буфера и нуклеазы S1 до конечной концентрации 100 ЕД в 1 мг ДНК, и инкубировать в течение 1 часа. Осадок ДНК добавлением 0,1 объема 3 М ацетата натрия и 1 объема изопропанола при комнатной температуре. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 20 мин при 4 ° C. Вымойте ДНК в 70% этаноле, и снова центрифугируют при 14000 оборотов в минуту в течение 10 минпри 4 ° C. Воздушно-сухой и растворить осадок ДНК в буфере TE. Измерение концентрации ДНК и визуализировать помощью гель-электрофореза. Обычно окончательное количество повторяющихся фракции ДНК представляет 35-50% от первоначальной суммы ДНК. 3. ДНК-зонда маркировки Два разных протоколов, используемых для маркировки BAC клонов ДНК-зонда и IGS рДНК. 3,1 BAC клона маркировки использовании ник-трансляции Извлечение BAC клонов ДНК из библиотеки BAC использованием Qiagen Большой набор Construct. Подготовка реакционной смеси для ник-трансляции маркировки на льду с конечным объемом 50 мкл: 1 мкг изолированы BAC клонов ДНК, 0,05 мМ каждого из немеченого дАТФ, дЦТФ, и дГТФ и 0,015 мМ дТТФ; 1 мкл Cy3-дУТФ (или другого флуорохромом); 0,05 мг / мл BSA, 5 мкл 10x ник-перевода буфера, 20 U ДНК-полимеразы I, U и 0,0012 ДНКазы. Инкубировать при 15 ° С в течение 20,5 часа. Остановить реакцию добавлением 1 мкл 0,5 М ЭДТА. Магазин зонда при -20 ° C в темном месте. 3,2 IGS рДНК маркировки с помощью ПЦР Подготовка реакционной смеси на льду с окончательным объемом 50 мкл: 200 нг геномной ДНК, 0,05 мМ каждого из немеченого дАТФ, дЦТФ, и дГТФ; 0,015 мм из дТТФ; 1 мкл Cy3-дУТФ (или другой флуорохромом), 5 мкл 10-кратный ПЦР-буфер, 50 пмоль вперед; ООН (GTGTGCCCCTTCCTCGATGT) и наоборот; GA (CTGGTTTGGTCGGCACGTTT) праймеры для амплификации IGS, и 10 из U Taq ДНК-полимеразы 14. Выполните ПЦР с использованием стандартных параметров ПЦР для амплификации IGS: 95 ° C / 5 мин х 1 цикл; (95 ° C / 30 сек, 50 ° C / 30 сек, 72 ° C / 30 сек) х 30 циклов 72 ° C / 5 мин х 1 цикл, и 4 ° C удерживать 14. Магазин зонда при -20 ° C в темном месте. 4. Флуоресцентный в гибридизация <eм> Эта рыба протокол включает в себя два варианта: первый для использования BAC клона ДНК в качестве зонда на митотических хромосомах Ae. Aegypti и Cx. quinquefasciatus, а второй для использования IGS рДНК на митотических хромосомах. gambiae. При использовании зондов BAC клонов ДНК, РНК показывать лечения шаги 4.3, 4.4, и одновременное слайд / зонд денатурации шагом 4.19. При использовании IGS рДНК, подготовить гибридизации смеси без C 0 фракций т ДНК, и пропустить отдельные слайды / зонд денатурирующих шагом 4.10, 4.11, 4.16, и 4.17. Инкубируйте слайды в 2х SSC в течение 30 мин при 37 ° C. Высушить слайды в серии из 70%, 80% и 100% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре, и воздух сухой. При выполнении рыбы с BAC клонов ДНК, переходите к шагу 4.5. Инкубируйте хромосомы препарата в 0,1 мг / мл РНКазы решение при парафильмом в течение 30 мин при 37 ° C. Мыть два раза в 2х SSC в течение 5 мин каждый при 37 ° C. Положить слайды яНС банка с 0,01% пепсина и соляной кислоты 0,037% раствора и инкубировать 5 мин при 37 ° C. Вымойте слайды в 1x PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Исправить хромосомы подготовку в банке с 1% формалина в 1x PBS получали из 10% нейтральный буферный формалин в течение 10 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды в 1x PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Высушить слайды в серии из 70%, 80% и 100% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре, и воздух сухие препараты при температуре 37 ° C. При выполнении рыбы с IGS, перейдем непосредственно к этапу 4,12 Денатурировать слайды в банку с предварительно нагретым 70% формамида в течение 2 мин при 72 ° С. Высушить слайды в серии холодно (-20 ° C) 70%, 80% и 100% этанолом в течение 5 мин каждая, и сухой воздух при 37 ° C. Подготовка гибридизации смеси. 5 мкл меченого зонда ДНК с шага 3, 10 мкл C 0 T ДНК из шага 2 с конечной концентрации 0,5 нг / мкл и 5 мкл 1 мкг / мкл ультразвуком ДНК спермы лосося для рыбы с IGS рДНК, готовитьгибридизации смеси без C 0 фракций т ДНК. Осадок ДНК добавлением 0,1 объема 3 М ацетата натрия и 2 объемов этанола. Хранить при -20 ° C в течение 1-3 часов. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту при 4 ° С в течение 20 мин, удалить этанол, и воздух сухой осадок при комнатной температуре. Тщательно растворить осадок в 10 мкл буфера гибридизации. 50% формамида, 20% сульфата декстрана, 2x SSC При выполнении рыбы с IGS, перейдем непосредственно к этапу 4,18 Денатурировать смеси гибридизации в течение 7 мин при 97 ° C, и сразу же положить на льду в течение 1 мин. Prehybridize смеси при 37 ° С в течение 30 мин для предотвращения неспецифической гибридизации повторяющихся ДНК хромосом. Поместите 10 мкл гибридизации смеси на слайде, и крышка с крышкой 22×22 скольжения. Предотвращение образования пузырьков – пузырьки воздуха должны быть удалены с легким нажимом на покровное При выполнении FISH с ДНК BAC клона, перейдем непосредственно к этапу 4,20 <./ EM> Денатурировать зонда и хромосомной ДНК одновременно, используя нагревательный блок при 75 ° С в течение 5 мин. Клей покровного стекла по всему периметру использованием резинового клея. Выполнять в течение ночи гибридизации во влажной камере при температуре 37 ° C. Удалите резиновый клей и покровного из слайда. Вымойте слайд 2 мин в предварительно нагретой раствор 1 (0.4x SSC, 0,3% Nonidet-P40) при 73 ° C. Вымойте слайды в решение 2 (2x SSC, 0,1% Nonidet-P40) в течение 5 минут при комнатной температуре. Контрастирующая слайд, используя 0,001 мм YOYO-1 в 1x PBS в течение 10 минут во влажной камере при комнатной температуре. Установите в небольшом количестве продлить реагента Золотой antifade с крышкой скольжения. Анализ препаратов под флуоресцентным микроскопом, используя соответствующие наборы фильтров при 1000-кратном увеличении (рис. 4). 5. Представитель Результаты Насекомое идентификаторы находятся в каждом сегменте личинки. В зависимости от положения, тыс.еу превращаться в различных тканях у взрослой стадии насекомых. Идентификаторы, которые используются для подготовки хромосомы в этом протоколе, развиваются в ногах у взрослой стадии комара. Эти идентификаторы расположены на брюшной стороне личиночной грудной клетки и четко видны через кутикулу под микроскопом (рис. 1). В начале 4-й этап личиночного возраста, идентификаторы имеют округлую форму (рис. 1А). Наибольшее число митозов, ~ 175 в одном ID 9, накапливаются на более позднее "овальные" стадии (рис. 1б), которые должны быть рассмотрены оптимальные этап для подготовки слайд. В это время промежуточной ID распадается на две: одна переходит в ногу, а другая превращается в крыло. Мы предпочитаем использовать большой идентификаторы ногой в "овальные" этап для подготовки слайд хромосомы. Рис. 1С представляет идентификаторов на последнем этапе 4-го развития взрослой личинки. На данном этапе,Идентификаторы уже превратилась в ноги и крылья, и содержат значительное количество дифференцированных тканей и низкое число митозов. Этот этап ID развития следует избегать хромосомы подготовке слайдов. Мы также рекомендуем выращивания личинок комаров при низких температурах. 16 ° C для Aedes и Culex и 22 ° C для Anopheles Это помогает увеличить количество митозов в идентификаторами 9. На рисунке 2 показан ID рассечение от грудной клетки из 4-го возраста личинки. Потому что кутикула живых насекомых трудно анализировать, мы рекомендуем использовать рассечение ножницами вместо иглы, обычно используемые для подготовки личинки. Наиболее важные процедуры получения высококачественного хромосомы подготовки является гипотонической обработки раствором. Для достижения наилучших результатов, мы удаляем кишечника и жир от личиночной грудной клетки до этого лечения. Отек ID клетки во время этой процедуры помогает распространять хромосомыа на слайде (рис. 3А). Надлежащее качество лечения гипотонического раствора можно легко узнать по круглой формы клеток в препаратах (рис. 3а, б). Клетки с овальной формой указывают на недостаточную гипотонического раствора для обработки (рис. 3). Чтобы быть выбраны для рыбы, хромосомы подготовка должна содержать по меньшей мере 50 высококачественных спредов хромосомы. Как правило, ~ 90% из слайдов подготовлены с использованием этого протокола есть достаточное качество для рыб 9. Мы представляем два немного разных рыб протоколов: расширенный протокол для рыбы с помощью геномных BAC клонов ДНК-зонда на митотических хромосомах Aedes и Culex и простой протокол рыбы IGS рДНК на митотических хромосомах Anopheles. Генома Aedes и Culex очень повторяющиеся из-за чрезмерной мобильных элементов 7,8. Таким образом, выполнение рыбы, которая утilizes геномного клона BAC ДНК в качестве зонда, требует добавления немеченого повторяющихся фракции ДНК зонд, чтобы заблокировать неспецифической гибридизации ДНК повторов на хромосомах. Для извлечения повторяющихся фракции ДНК, геномной ДНК денатурируют при 120 ° С в течение 2 мин. Кипение ДНК при высокой температуре также помогает получить ДНК фрагментов 200-500 бп. ДНК позволил реассоциировать после этого лечения. Часто повторяющихся фрагментов ДНК, как правило, найти свою пару на реассоциации быстрее, чем ДНК с уникальной последовательности делает. В результате, реассоциации ДНК следующим C 0 х т кривой, где C 0 является начальной концентрации одноцепочечной ДНК, а Т reannealing времени. ДНК фракций с C 0 значение т равно 10-4 – 10-1 или 100-102 считаются высоко и умеренно повторяющиеся, соответственно. Время реассоциации для разных фракций C 0 T ДНК может быть рассчитана с использованием йэлектронной формуле T = C 0 T X × 4,98 / C 0, где Т – время инкубации, C 0 T X – C 0 T фракции (C0t 1 = 1, C 0 T 2 = 2 и т.д.) и C 0 – Начальная концентрация ДНК в мкг / мкл 15 (табл. 1). После реассоциации, одноцепочечной ДНК переваривается использованием S1 нуклеазы. Мы предпочитаем использовать все фракции C 0 T ДНК до C 0 T 3 вместе, а обычно используется C 0 T 1 ДНК фракции. Эти C 0 T фракции включают некоторые из умеренно повторяющихся последовательностей ДНК и вместе как правило, представляют 35-50% от первоначальной суммы геномной ДНК в Ae. Aegypti. Правильное соотношение между меченым зондом ДНК и немеченого C 0 T ДНК фракции зависит от повторяющихся компонентов ДНК в каждой конкретной клон BAC. В среднем, мы используем 1:20 зонд C 0 тДНК фракции пропорции для получения приемлемого сигналов / фон рыбы результат. Предварительной гибридизации ДНК-зонда с C 0 T ДНК фракций в трубке в течение 30 мин до фактического гибридизации на слайде также помогает уменьшить фон. Маркировка, гибридизация себя, и мытье в этом протоколе выполняются с использованием стандартных условиях 12. FISH результаты двух по-разному помечены BAC клонов ДНК-зонды на митотических хромосомах Ae. Aegypti и Cx. quinquefasciatus показаны на рисунках 4а и B, соответственно. BAC зондов ДНК клона производят сильные сигналы в одном положении на хромосомах. Хромосомы показано на рисунке 1, контрастно с YOYO-1 йодид. Этот краситель производит лучшие полосы узоров на Ae. Aegypti хромосомы 9. Кроме того, другие флуоресцентные красители, такие как DAPI или пропидия йодид, могут быть использованы для гоcounterstaining электронной хромосомы. Для подавления фотообесцвечивания из слайдов, мы используем продлить Золотой antifade монтаж среды. Этот реагент имеет хорошую способность сохранения сигнала, а также может быть легко удалена из слайд промывкой 1x PBS, если это необходимо использовать те же слайды в течение нескольких гибридизации. Простой вариант FISH протокол предназначен для гибридизации IGS рДНК на митотических хромосомах Anopheles. Рибосомных генов в Anopheles представлены в виде полиморфных кластера генов, расположенных на половых хромосомах 16. ДНК-зонда в этом протоколе обозначена с использованием стандартных ПЦР-реакции, добавив флуоресцентно меченые Cy3 или Cy5 дНТФ. Из-за блокирования неспецифической гибридизации ДНК, повторяющиеся в эухроматине не нужно, все шаги, связанные с использованием C 0 фракций т ДНК опущены. Вместо этого, хромосомные препараты предварительно РНКазой для предотвращения гибридизации IGS рДНК вядрышко. Хромосомы и ДНК-зонда денатурировали одновременно при нагревании слайд вместе с зондом в системе гибридизации при 75 ° С в течение 5 мин. Гибридизации и промывки в этом протоколе также выполняются с использованием стандартных условий для рыбы 12. В результате рыба показано на рисунке 4C: полиморфизм гибридизации IGS рДНК между двумя Х-хромосомами четко виден. Концентрация ДНК мкг / мкл Reannealing время, мин C 0 T 2 0,1 100 0,3 33 0,5 20 0,7 14 0,9 11 1 10 <tdRowSpan = "6"> C 0 T 3 0,1 150 0,3 50 0,5 30 0,7 21 0,9 17 1 15 Таблица 1. Концентрация ДНК и reannealing время для подготовки C 0 t2 и t3 C 0 фракций. Рисунок 1 Этапы развития ID в 4-й личинки возраста: а) ранние "круглой формы" стадии, B) промежуточный "овальной формы" этап – оптимальный для подготовки хромосомы, С) поздняя стадия – подходит для хромосоме препаратов. . Позиции идентификаторов указано стрелками на брюшной стороне личиночной грудной клетки. Рисунок 2 Шаги ID рассечения: A) обезглавленное личинки (в направлении сокращения указаны стрелками), б) личинки с расчлененным кишечника при гипотонической обработки раствором (идентификаторы набухают и становятся почти невидимыми); C) личинки после решения приложения Карнуа (. идентификаторы становятся белыми и хорошо видны); D) расчлененный идентификаторов в решении Карнуа. Позиции идентификаторов в личинку обозначены звездочками. Рисунок 3 различных качеств хромосомы распространяется: а) идеально распространения хромосомы – округлой формы клеток демонстрирует достаточную обработку идентификаторов в гипотонический раствор, B) идеально гипотонической обработки – хромосомы немного undersquashed, С) бедные распространение хромосомы. – результатнедостаточное лечение гипотонических указывается овальной формы клеток. Рисунок 4. Примеры рыбы с ВАС-клонов (A, B) и IGS рДНК (C) в хромосомах Ae. Aegypti (A), Cx. quinquefasciatus (B), и. gambiae (C). 1, 2 и 3 – это число хромосом, X – женская половая хромосома в. gambiae.