Différencier les rôles fonctionnels de l'expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l'intestin de souris par greffe de moelle osseuse
Summary
La greffe de moelle osseuse fournit un moyen de changer le génotype des cellules de moelle osseuse dérivées. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et les cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés, la greffe de moelle osseuse peut modifier les cellules de moelle osseuse provenant d'un génotype différent sans modifier le génotype non-cellulaire de la moelle osseuse extraite.
Abstract
Pour comprendre le rôle d'un gène dans le développement de la colite, nous avons comparé les réponses des souris de type sauvage et sur les gènes d'intérêts souris knockout déficientes à la colite. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et de cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés de l'hôte, mais il est possible de différencier le rôle d'un gène d'intérêt dans des cellules de moelle osseuse dérivées et non de la moelle osseuse des cellules dérivées de la technique de transplantation de moelle osseuse. Pour changer la moelle osseuse de cellules dérivées du génotype des souris, la moelle osseuse d'origine des souris receveuses ont été détruites par l'irradiation, puis remplacé par un nouvel os moelle du donneur du génotype différent. Lorsque de type sauvage moelle osseuse du donneur souris a été transplanté à des souris knock-out, nous avons pu générer des souris knock-out avec l'expression du gène de type sauvage dans des cellules de moelle osseuse dérivées. Alternativement, lorsque les souris knock-out moelle osseuse du donneur a été transplanté à des souris de type sauvage bénéficiaires, souris de type sauvage sans gène d'intérêt exprimantde la moelle osseuse des cellules dérivées ont été produites. Cependant, la greffe de moelle osseuse peut ne pas être 100% complet. Par conséquent, nous avons utilisé cluster de différenciation (CD) molécules (CD45.1 et CD45.2) comme marqueurs de cellules du donneur et du receveur de suivi de la proportion de cellules de moelle osseuse du donneur provenant de souris receveuses et la réussite de la greffe de moelle osseuse. Souris de type sauvage avec des souris knock-out et génotype CD45.1 avec CD45.2 génotype ont été utilisés. Après l'irradiation des souris receveuses, les cellules du donneur de moelle osseuse de différents génotypes ont été infusée dans les souris receveuses. Lorsque la moelle osseuse nouvelle régénérée pour reprendre son immunité, les souris ont été provoquées par un agent chimique (sulfate de sodium dextrane, le MAS 5%) pour induire une colite. Ici, nous avons également montré la méthode pour induire une colite chez la souris et d'évaluer le rôle du gène d'intérêt exprimé à partir de la moelle osseuse des cellules dérivées. Si le gène d'intérêt dans les cellules osseuses dérivées joue un rôle important dans le développement de la maladie (comme Escherichiatis), le phénotype des souris receveuses avec greffe de moelle osseuse peut être significativement modifiée. À la fin des expériences colite, la moelle osseuse de cellules dérivées dans le sang et la moelle osseuse ont été marquées avec des anticorps contre CD45.1 et CD45.2 et leur rapport quantitatif de l'existence pourrait être utilisée pour évaluer la réussite de la greffe de moelle osseuse par cytométrie en flux. Succès de la transplantation de moelle osseuse doit montrer une grande majorité de génotype donneur (en terme de marqueur molécule CD) sur le génotype destinataire à la fois dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette approche greffe de moelle osseuse est adapté à la recherche d'immunologie de la colite, une infection, le cancer, l'obésité et d'autres maladies. Cette expérience greffe de moelle osseuse est nécessaire lorsque le gène d'intérêt est exprimé à la fois dans la moelle osseuse dérivées et les cellules de moelle osseuse non dérivés et le gène d'intérêt est soupçonnée de servir de médiateur maladie par les cellules de la population soit. Par exemple, peptide antimicrobien cathél…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la subvention pilote et étude de faisabilité de l'UCLA-CURE Center, la maladie de Crohn et la colite Foundation of America Award de développement de carrière (# 2691) et l'Institut National de la Santé NIDDK K01 (DK084256) le financement à l'honorable Wai Koon.
Opération d'irradiation de la moelle osseuse a été aidé par Bernard Levin et cuisine Scott de l'UCLA Center for AIDS Research souris / humain installation de base Chimera. Opération de cytométrie en flux a été aidé par l'UCLA installation de base de vecteur.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
| Vaccutainer | BD | #8000813 |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
| Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
Riferimenti
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
