Summary

区分功能基因表达的作用,通过骨髓移植免疫和非免疫细胞在小鼠结肠炎

Published: October 01, 2012
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Summary

骨髓移植提供了一种方法来改变的骨髓衍生细胞的基因型。如果感兴趣的基因的表达在两个骨髓来源的细胞和非骨髓来源的细胞,骨髓移植可以改变到一个不同的基因型的骨髓来源的细胞,不改变非骨髓来源的细胞的基因型。

Abstract

要了解结肠炎的发展中的一个基因的作用,我们比较了野生型小鼠的反应和兴趣基因缺陷的基因敲除小鼠结肠炎。如果该基因的利益是表示在两个骨髓来源的细胞和非骨髓来源的细胞的主机,但是,它是可能的感兴趣的基因的骨髓来源的细胞和非骨髓分化的作用衍生骨髓细胞​​移植技术。要改变的骨髓细胞基因型的小鼠,原来的受体小鼠的骨髓被破坏的照射,然后更换新的捐赠者的骨髓不同基因型。当野生型小鼠供体骨髓移植到基因敲除小鼠中,我们可以产生与野生型的骨髓来源的细胞中的基因表达的基因敲除小鼠。或者,基因敲除小鼠时,供体骨髓移植到无利益基因表达的野生型受体小鼠,野生型小鼠从骨髓衍生细胞。然而,骨髓移植可能不是100%完成。因此,我们利用集群的分化(CD)分子(CD45.1和CD45.2)作为供体和受体细胞的标记,跟踪捐赠者的骨髓来源细胞在受体小鼠的骨髓移植成功的比例。 CD45.1 CD45.2基因型的基因型和基因敲除小鼠与野生型小鼠。受体小鼠的照射后,供体骨髓细胞注入受体小鼠不同基因型。当新的骨髓再生接管其免疫,将小鼠用化学剂(硫酸葡聚糖钠,DSS 5%)的挑战,以诱发大肠炎。在这里,我们还表明,该方法诱导结肠炎的小鼠的骨髓来源的细胞从表达感兴趣的基因的作用的评价。如果该基因的利益从骨来源的细胞的疾病的发展中起着重要的作用(如大肠杆菌炎),骨髓移植的受体小鼠的表型可以显着改变。结肠炎实验结束时,骨髓来源的血液和骨髓中的细胞进行标记与抗CD45.1和CD45.2和其定量的存在比例可用于骨髓移植的成功,通过流式细胞术评价。应显示成功的骨髓移植供体基因型在长期的CD分子标记对收件人基因型的受体小鼠的骨髓和血液中的绝大多数。

Protocol

1。在你启动技术注意事项我们建议同时使用C57/BL6野生型小鼠和基因敲除小鼠可以购买相应的CD分子的小鼠实验,因为从各大鼠标厂商。 因为它是难以跟踪的野生型小鼠和衍生的基因敲除小鼠骨髓移植后的供体细胞,它是必要使用CD45.1代表野生型小鼠的小鼠。 (CD45.1 C57/SJL WT小鼠杰克逊实验室的股票002014)。 大多数鼠标的菌落CD45.2。我们的基因敲除小鼠属于CD45.2的基因型(?…

Representative Results

如果该基因的利益结肠炎的开发过程中,起到了重要的作用的免疫细胞,通过骨髓移植(WT KO KO,以WT)小鼠骨髓不同基因型,DSS结肠炎应该有一个改变的响应。用于确定的结肠炎的严重程度的最重要的参数之一是结肠组织的H&E染色。结肠组织结构的变化和炎症的迹象,H&E组织学评分系统,可以定量评估。 H&E组织学得分DSS结肠炎模型的标准可以在这里找到2。另外,也可诱发化学诱导?…

Discussion

骨髓移植的方法是适用于免疫学研究的结肠炎,感染,癌症,肥胖症和其他疾病的。基因的利益时,需要在两个骨髓来源的和非骨髓来源的细胞和基因的利益被怀疑由细胞介导疾病无论从人口表示这骨髓移植实验。例如,抗菌肽抗菌肽调节急性结肠炎。但是,它是表示在两个上皮细胞和免疫细胞(如巨噬细胞)。然后,我们用骨移植来定义人口的细胞调节小鼠急性肠炎。结肠炎的严重程度显着改?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作是由加州大学洛杉矶分校的治疗中心,克罗恩病和结肠炎基金会美国职业发展奖(2691)和国立卫生研究院NIDDK K01(DK084256)的资金就围冠试点和可行性研究的资助。

伯纳德·莱文和Scott厨房加州大学洛杉矶分校艾滋病研究鼠/人嵌合体的核心设施中心的协助下照射骨髓操作。流式细胞仪操作协助加州大学洛杉矶分校矢量的核心设施。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

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