Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais
Summary
Um procedimento otimizado para purificar crista neural derivados progenitores neuronais a partir de tecidos fetais de camundongos é descrito. Este método tira partido da expressão a partir de alelos repórter fluorescente para isolar populações discretas por fluorescência-activated separação de células (FACS). A técnica pode ser aplicada para isolar subpopulações neuronais ao longo do desenvolvimento ou a partir de tecidos adultos.
Abstract
Durante o desenvolvimento da crista neural (CN) derivados progenitores neuronais migrar do tubo neural para formar gânglios autonômicos em órgãos viscerais, como o intestino e do trato urinário inferior. Tanto durante o desenvolvimento e em tecidos maduros estas células são muitas vezes muito dispersos ao longo tecidos de modo a que o isolamento de populações discretas usando métodos como a laser de captura de micro-dissecção é difícil. Podem, contudo, ser directamente visualizadas por expressão de repórteres fluorescentes conduzidos a partir de regiões reguladoras de genes específicos de neurónios como tirosina hidroxilase (TH). Nós descrevemos um método optimizado para altos rendimentos de TH + de viável progenitoras neuronais a partir de tecidos de rato fetal viscerais, incluindo intestino e inferior do tracto urogenital (LUT), com base na dissociação e de fluorescência-activated separação de células (FACS).
O gene codifica Th a enzima limitante para a produção de catecolaminas. Entéricas progenitores neuronais começam a expressar TH durção a sua migração no intestino fetal 1 e TH também está presente em um subconjunto de adultos neurónios dos gânglios pélvicos 2-4. O primeiro aparecimento dessa linhagem ea distribuição destes neurónios em outros aspectos da LUT, e seu isolamento não foi descrita. Progenitores neuronais que expressam TH pode ser prontamente visualizadas por expressão de GFP em ratinhos que transportam o transgene construto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Nós imaged expressão deste transgene em ratinhos fetais para documentar a distribuição de TH + células na LUT desenvolver-se a 15,5 dias pós coito (DPC), designando a manhã de detecção do conector como 0,5 DPC, e observou-se que um subconjunto de células progenitoras neuronais no coalescência pélvica gânglios expressa EGFP.
Para isolar TH LUT + progenitores neuronais, otimizamos métodos que foram inicialmente utilizados para purificar células da crista neural estaminais do intestino do rato fetal 2-6. Esforços anteriores para isolar NC derivados populações invocadosdigestão com um cocktail de colagenase e tripsina para se obter suspensões de células por citometria de fluxo. Nas nossas mãos estes métodos produzido suspensões de células a partir da LUT com viabilidade relativamente baixo. Dada a incidência já baixo de progenitores neuronais nos tecidos fetais LUT, partimos para otimizar métodos de dissociação de tal forma que a sobrevivência da célula nos dissocia finais seriam aumentados. Nós determinamos que a dissociação suave em Accumax (Cell Technologies, Inc Inovadoras), manual de filtragem, classificação e fluxo a baixas pressões nos permitiram alcançar consistentemente maior sobrevivência (> 70% do total de células) com rendimentos posteriores de progenitores neurais suficientes para a análise a jusante. O método descrevemos podem ser amplamente aplicado para isolar uma variedade de populações neuronais a partir de qualquer fetais ou adultos tecidos de murino.
Protocol
Discussion
Linhas de rato que expressam repórter repórteres fluorescentes estão se tornando amplamente disponível através de múltiplos esforços no murino genética comunidade 1,8,9. Como resultado do método de dissociação ilustrado aqui pode ser amplamente aplicado para o isolamento de discretas subtipos neuronais com base em neurotransmissor ou padrões de expressão de receptor a partir de ambos os tecidos fetais ou adulto. Embora tenhamos optimizado este método baseado na expressão de um transgene repórt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Catherine Alford para sugestões de dissociação celular e métodos Weller Kevin, Flaherty e David Matlock Bretanha para apoio no Resource Citometria de Fluxo compartilhada no Vanderbilt University Medical Center e Melissa A. Musser de assistência artística com ilustrações. Agradecemos os drs. Jack Mosher e Sean Morrison para o conselho na implementação de isolamento de células progenitoras neuronais. O recurso de Citometria de Fluxo VMC partilhada é suportado pela Ingram Vanderbilt Câncer Center (P30 CA68485) ea Digestive Disease Vanderbilt Research Center (P30 DK058404). Este trabalho foi financiado por recursos do EUA National Institutes of Health bolsas DK064251, DK086594 e DK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
Riferimenti
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