Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen
Summary
Een geoptimaliseerde procedure om neurale lijst afgeleide neuronale voorlopercellen uit foetaal weefsel muis te zuiveren wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van expressie van fluorescerende reporter allelen van discrete populaties isoleren door middel van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS). De techniek kan worden toegepast neuronale subpopulaties isoleren door ontwikkeling of volwassen weefsels.
Abstract
Tijdens de ontwikkeling neurale lijst (NC)-afgeleide neurale voorlopercellen weg te migreren van de neurale buis op autonome ganglia vormen in viscerale organen zoals de darm en de lagere urinewegen. Zowel tijdens de ontwikkeling als in volwassen weefsels deze cellen worden vaak op grote schaal verspreid over weefsels, zodat isolatie van discrete populaties met behulp van methoden zoals laser capture micro-dissectie moeilijk is. Ze kunnen echter direct worden gevisualiseerd door de expressie van fluorescerende verslaggevers aangedreven door regulerende gebieden van neuron-specifieke genen, zoals Tyrosine hydroxylase (TH). Wij beschrijven een werkwijze geoptimaliseerd voor een hoog rendement van levensvatbare TH + neuronale voorlopers van foetale muis inwendige weefsels inclusief darm en lagere urogenitale (LUT), gebaseerd op dissociatie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
De Th-gen codeert voor het snelheidsbepalende enzym voor de productie van catecholamines. Enteric neuronale voorlopercellen beginnen TH tijdens drukkenIng hun migratie in de foetale darm 1 en TH is ook aanwezig in een subgroep van de volwassen bekken ganglia neuronen 2-4. De eerste verschijning van deze lijn en de verdeling van deze neuronen in andere aspecten van de LUT, en hun isolement is niet beschreven. Neuronale voorouders uiten TH kan gemakkelijk worden gevisualiseerd door de expressie van EGFP in muizen die het transgen construct Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. We afgebeeld uitdrukking van dit transgen in foetale muizen om de verdeling van de TH + cellen te documenteren in de ontwikkelingslanden LUT op 15,5 dagen na de coïtus (DPC), de aanwijzing van de ochtend van plug detectie voor 0,5 dpc, en merkte op dat een subset van neuronale voorlopercellen in het samenvoegen bekken ganglia express EGFP.
Om LUT TH + neuronale voorlopercellen te isoleren, hebben we geoptimaliseerde methoden die in eerste instantie werden gebruikt om de neurale lijst stamcellen uit foetaal muis darm 2-6 te zuiveren. Voorafgaand inspanningen om NC-afgeleide bevolking vertrouwd te isolerenknippen met een cocktail van collagenase en trypsine om celsuspensies te verkrijgen voor flowcytometrie. In onze handen deze methoden celsuspensies uit de LUT met relatief lage levensvatbaarheid. Gezien de al lage incidentie van neuronale voorlopercellen in foetale LUT weefsels, we wilden dissociatie methoden zodanig dat overleving van de cel in de laatste distantieert zou worden verhoogd optimaliseren. We hebben vastgesteld dat zachte dissociatie in Accumax (innovatieve Cell Technologies, Inc), handmatig filteren, sorteren en de stroom bij lage druk liet ons toe om steeds grotere overleving (> 70% van het totaal cellen) bereiken met latere opbrengst van de neuronale voorlopercellen voldoende voor downstream-analyse. De methode beschreven kunnen ruwweg worden toegepast om een verscheidenheid van neuronale populaties isoleren van een foetus of volwassen muizen weefsels.
Protocol
Discussion
Muis reporter lijnen uitdrukken TL-verslaggevers zijn steeds op grote schaal beschikbaar via diverse inspanningen in het muizen genetica gemeenschap 1,8,9. Als gevolg van de dissociatie methode hier weergegeven kan breed worden toegepast voor het isoleren van discrete neuronale subtypes op neurotransmitters of receptor expressiepatronen van een foetaal of volwassen weefsels. Hoewel we deze methode geoptimaliseerd op basis van de expressie van een transgen fluorescerende reporter kan ook worden toegepast op mo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Catherine Alford bedanken voor suggesties op cel dissociatie methoden en Kevin Weller, David Flaherty en Bretagne Matlock voor steun in de flowcytometrie gedeelde bron aan de Vanderbilt University Medical Center en Melissa A. Musser voor artistieke hulp bij illustraties. Wij danken Drs. Jack Mosher en Sean Morrison voor advies over de uitvoering van isolatie van neuronale voorlopercellen. De VMC flowcytometrie gedeelde bron wordt ondersteund door de Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) en de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Dit werk werd ondersteund door de financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies DK064251, DK086594 en DK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
Riferimenti
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
