Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur
Summary
La génération et la caractérisation des tumeurs des cellules T spécifiques en utilisant des souris humanisés est décrit ici. Human tissu thymique et génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines sont transplantées dans des souris immunodéprimées. Cela se traduit par la reconstitution d'un système immunitaire humain ingénierie permettant l'examen in vivo des réponses anti-tumorales immunitaires.
Abstract
De petits modèles animaux tels que des souris ont été largement utilisées pour étudier les maladies humaines et à développer de nouvelles interventions thérapeutiques. Malgré la richesse des informations obtenues à partir de ces études, les caractéristiques uniques de l'immunité de la souris ainsi que la spécificité d'espèce des maladies virales comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) a conduit au développement de modèles murins humanisés. Les modèles précédents impliquaient l'utilisation de C. B 17 scid / scid souris et la transplantation de l'homme thymus foetal et le foie du fœtus appelés ton / liv (SCID-hu) 1, 2 ou le transfert adoptif de l'homme leucocytes du sang périphérique (SCID-huPBL ) 3. Les deux modèles ont été principalement utilisés pour l'étude de l'infection par le VIH.
L'une des principales limites de ces deux modèles est le manque de reconstitution stable de cellules immunitaires humaines dans la périphérie pour en faire un modèle plus physiologiquement pertinente pour étudier la maladie du VIH. À cette fin, le bourdonnement BLTmodèle de souris anized a été développé. BLT est synonyme de moelle osseuse / foie / thymus. Dans ce modèle, de 6 à 8 semaine vieux NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) des souris immunodéprimées recevoir l'implant ton / liv comme dans le modèle de souris SCID-hu ne doit être suivie d'une deuxième transplantation de cellules souches hématopoïétiques humaines 4. L'avantage de ce système est la reconstitution complète du système immunitaire humain dans la périphérie. Ce modèle a été utilisé pour étudier l'infection à VIH et la latence 5-8.
Nous avons généré une version modifiée de ce modèle dans lequel nous utilisons génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines (HHSC) pour construire l'implant ton / liv suivie d'une injection autologue de transduction HHSC 7, 9. Cette approche se traduit par la génération de lignées génétiquement modifiées. Plus important encore, nous avons adapté ce système pour étudier le potentiel de générer des cellules fonctionnelles T cytotoxiques (CTL) exprimant un mélanome récepteur des cellules T spécifiques. En utilisant ce modèle, nous avons pu évaluer la fonctionnalité de notre CTL transgénique en utilisant en direct par émission de positrons (TEP) pour déterminer la régression tumorale (9).
L'objectif de ce protocole est de décrire le processus de génération de ces souris transgéniques et d'évaluer l'efficacité di vivo utilisant l'imagerie TEP en direct. Comme une note, car nous utilisons des tissus humains et les vecteurs lentiviraux, nos installations sont conformes aux directives du NIH pour la CDC de biosécurité de niveau 2 (BSL2) avec des précautions particulières (BSL2 +). En outre, les souris NSG sont gravement immunodéprimés par conséquent, leur logement et de maintenance doivent être conformes aux normes les plus élevées de santé ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle modifié BLT souris humanisée associée à l'imagerie TEP in vivo sont des outils puissants pour étudier les maladies chroniques de l'homme. Ce système prend le modèle de souris BLT et elle avance au-delà de la portée limitée de recherche sur le VIH. En outre, il est un grand système dans lequel nous pouvons examiner les divers protocoles de thérapie génique ainsi que des techniques de diagnostic avant qu'ils ne puissent atteindre le milieu clinique. Celui-ci couplée avec le fa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Alvin et Larry Welch Pang pour leur assistance technique. Ce travail a été financé en partie par le National Institutes of Health (NIH) P50 CA086306 prix, le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) des subventions RC1-00149-1 et RS1-00203-1; prix CIRM Faculté Nouvelle-RN2 00902-1 , le Centre de Caltech-UCLA commun pour la médecine translationnelle, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, l'UCLA AIDS Institute, les outils du CIRM et du Prix de la technologie RT1-01126, et le Programme de recherche multicampus UC et initiatives de la Californie Centre de Découverte médicament antiviral (nombre MRPI-143226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
Riferimenti
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- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
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- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
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