Medição de condutividade hidráulica da folha e da condutância estomática e as respostas a irradiância e Desidratação Usando a evaporação Método Flux (EFM)

1. Condutância da folha de medição hidráulica para Folhas hidratado (K max) Colete tiros de preferência à noite ou a noite de tal forma que as tensões do xilema são baixos, corte no ar e coloque em saco plástico escuro repleto de toalhas de papel molhado. No laboratório, recut pelo menos dois nodos a partir do final de cada tiro sob a água. Deixe disparar hidratar durante a noite em água pura, ou outra solução a ser usado para as medições de folha K. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. Corte a folha do tiro com uma lâmina de barbear fresco sob solução fluxo parcialmente desgaseificado. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. Recomendamos desgaseificação a solução durante a noite num frasco utilizando uma bomba de vácuo, mas outros métodos podem ser utilizados. Envoltório parafilme pré-esticada ao redor da petiole para assegurar uma boa vedação entre o pecíolo e tubos. Este passo é especialmente útil para não-redondas pecíolos, como embrulho parafilme extra vai ajudar em volta do pecíolo para caber dentro da tubulação. Pasta dental pode ser aplicado ao pecíolo antes de envolver o parafilme para preencher sulcos em pecíolos. Ligue a folha de tubo de silicone em água ultrapura para evitar que o ar que entra no sistema. À medida que a folha é levantada acima da fonte de água, a água na tubagem está sob pressão subatmosférica, e, portanto, a vedação é boa se nenhum ar é aspirado para dentro do tubo durante a medição. Como alternativa para vedar o pecíolo directamente na tubagem de silicone, com um encaixe de compressão da junta de borracha podem ser usados ​​(por exemplo, (Omnifit A2227 adaptador furo; Omnifit, Cambridge, Reino Unido); esta abordagem é útil para o pecíolo com formas especialmente complexos, ou por folhas de relva , que pode ser envolvida em torno de uma vareta de vidro e seladas com o encaixe de compressão. Quando possível, selando o pecíolo directamente em silicone tubagem tem a vantagem de ser rápida e deixando uma junção pecíolo-tubo, que é transparente, permitindo que as bolhas sejam mais facilmente vistos. A tubagem liga a folha de tubo rígido correr para um cilindro graduado no equilíbrio (± resolução 10 ug), que regista dados cada 30 segundos a um computador (por exemplo, utilizando "Balance Link" Software; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Suíça) para o cálculo da taxa de fluxo através da folha. As folhas devem ser realizadas para cima superfície adaxial em molduras de madeira amarradas com linha de pesca acima de um ventilador grande caixa e sob uma fonte de luz (> 1.000 m 2 mol • • s -1 radiação fotossinteticamente ativa de alta irradiância medições), ligeiramente acima do nível de o menisco no cilindro graduado. A folha deve ser colocada acima da água no cilindro graduado para assegurar que a água em movimento para a folha é impulsionado pela transpiração, e que não entram na folha sob pressão devido à gravidade, como o fariaser o caso se a folha foi colocado abaixo do menisco da água no cilindro. Pequenos recipientes cheios com uma toalha de papel molhado é colocado dentro da câmara de equilíbrio para assegurar o ar no equilíbrio é saturado com água, evitando assim a evaporação a partir da fonte de água para a atmosfera na balança. Esta possibilidade pode ser verificada por travar a fluir para a folha, usando uma válvula de torneira de quatro vias na tubagem, e verificar que a massa do cilindro de água sobre o saldo não diminui. Coloque um recipiente de Pyrex transparente cheio de água acima da folha para absorver o calor da lâmpada. Manter a temperatura da folha, entre 23 ° C e 28 ° C durante toda a experiência por adição de água mais fria para o recipiente de Pyrex de tal modo que a lâmpada de aquecimento não aquece o recipiente de Pyrex suficiente para aquecer o ar em torno da folha inferior. Permitir que a folha a transpirar em cima do aparelho, pelo menos, 30 min, dando assim tempo suficiente para aclimatar a alta irradiância e additionally taxa de fluxo até que tenha se estabilizado, sem tendência para cima ou para baixo, e com um coeficiente de variação <5%, pelo menos no local de medição 5-10 feitas a intervalos de 30 seg de fluxo. É essencial para a taxa de fluxo para atingir um estado de equilíbrio, porque este método pressupõe uma folha Ψ estável. Estudos anteriores encontraram estes critérios para ser suficiente para a estabilização do caudal (E), folha folha Ψ e K; testes com períodos mais longos de medição após fluxo estável foi estabelecido não mostrou qualquer relação de folha K para o tempo de medição de cada um dos sete espécies de uma gama gama de folha capacitância 17,18. Estabilização geralmente demora de 30 minutos ou menos, mas, em algumas espécies podem requerer mais do que uma hora para algumas espécies. Nota: Quando o caudal é muito baixa (<8 ug s -1), a estabilidade pode ser determinado usando a média das últimas cinco intervalos de 30 seg. </p> Descarte as medições se o fluxo muda de repente, quer devido ao fechamento dos estômatos súbita, ou fugas resulta do selo ou bloqueio no sistema por partículas ou bolhas de ar. Quando o fluxo se estabiliza, registrar a temperatura da folha com um termopar. Remover rapidamente a folha do tubo, dab secar o pecíolo e colocar a folha para um saco selável, que tinha sido previamente exalado em, para interromper a transpiração. Deixe que a folha se equilibrar no seu saco, pelo menos, 20 min. A média dos últimos 10 medições da vazão. Esta será a sua medição E. Quando a folha é equilibrada, medir o potencial da água na última folha (Ψ final) com uma câmara de pressão. Medir a área foliar com um digitalizador de mesa e software de processamento de imagem, ou com um medidor de área foliar. K folha é calculado como E / ΔΨ-folha (onde ΔΨ folha = Ψ finais </sub> – 0 MPa) e mais normalizada pela área foliar. As unidades estão em mmol m -2 s -1 MPa -1. Porque a folha está posicionada logo acima do nível da água no cilindro graduado, o efeito da gravidade na redução da pressão de água que entra na folha seria insignificante, especialmente em relação ao último Ψ, que é sempre> MPa -0,1. Para corrigir as alterações na folha K induzida por dependência da temperatura da viscosidade da água 15,19,20, padronizar os valores de K da folha a 25 ° C, utilizando a seguinte equação: Condutância estomática (g s) pode ser determinada como E dividido pela diferença de pressão entre folha e de vapor do ar, equivalente à pressu vapordéfice re (DPV), determinada utilizando uma temperatura e sensor de humidade relativa adjacente à folha. VPD é calculada usando a seguinte equação 21 onde RH é a humidade relativa, VP é a pressão de vapor de saturação do ar (em kPa; uma função da temperatura, de acordo com a equação de Buck Arden 22), e AP, a pressão atmosférica (em kPa). 2. Medição de condutância da folha hidráulica para folhas desidratadas Colete tiros de preferência à noite ou a noite de tal forma que as tensões do xilema são baixos, corte no ar e coloque em sacos plásticos escuros cheios de toalhas de papel molhado. No laboratório, recut pelo menos dois nodos a partir do final de cada tiro sob a água. Deixe disparar hidratar durante a noite em água pura, ou outra solução a ser utilizado para o K lemedições AF. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. Cortar brotos em segmentos com pelo menos três folhas sob água ultrapura e desidratar tiros com um ventilador por diferentes períodos de tempo para um intervalo de valores da folha Ψ. Uma vez que tiros são desidratadas, coloque sacos sealable (Whirl-Pak; Nasco, Fort Atkinson, WI, EUA), que tenham sido previamente exalado em) em torno de cada folha do tiro, e em seguida, coloque a filmagem inteira em um grande saco lacrado com papel molhado toalha. Deixe a filmagem equilibrar durante pelo menos 30 min (para sessões fortemente desidratados vezes equílibrio mais longos podem ser necessários). Após o equilíbrio, imposto a folha superior e inferior e medida inicial Ψ folha (Ψ = o) utilizando uma câmara de pressão. Descartar o tiro, se a diferença na folha Ψ destas duas folhas é superior a 0,1 MPa (por stronfolhas desidratadas gly, este intervalo pode ser alargado a 0,3 MPa). A terceira folha é então usado para determinar K foliar e g s com a EFM, seguindo as etapas de 1,2 -1,18 acima. Notavelmente, E estado estacionário pode ser obtida, mesmo para as folhas que foram severamente folhas desidratadas, como estômatos abrem e gerar valores substancialmente maiores do que a condutância cuticular 17 g s. Para a construção das curvas de vulnerabilidade hidráulicos, calcular K folha utilizando o último Ψ como no passo 1.16, e, em seguida, os valores de K da trama folha contra o que for mais baixo, o Ψ Ψ ou final, ou seja, a mais forte desidratação experimentado pela folha durante a experiência (= Ψ menor). Do mesmo modo, a queda de g s, em resposta a desidratação da folha pode ser determinado através da representação gráfica g s contra Ψ menor. Trabalho anterior tem sh desidratação que induz próprio, pelo menos, parcialmente declínios irreversíveis em folha e K s g 14,16. Recomendamos obter pelo menos 6 valores de K foliares por 0,5 MPa de intervalo menor Ψ (esse intervalo pode ser reduzida para 0,25 MPa, se a espécie que está a trabalhar é muito vulnerável à desidratação). Realizar teste Dixon outlier em valores da folha de K para cada intervalo de água de 0,5 MPa potencial de menor Ψ para remover outliers em sua curva de vulnerabilidade 23. Porque as espécies diferem em suas respostas de K foliar e s g à desidratação 14,16, cabem funções diferentes para cada espécie e selecione a máxima verossimilhança (menor valor do AIC, ver 14 para detalhes). Recomendamos montagem, pelo menos, quatro funções anteriormente utilizados na literatura: linear (pg "fo: conteúdo largura =" 1.4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg "/>), sigmoidal ( ), Logística ( ) E exponencial ( ). 3. Resultados representativos O declínio da condutância hidráulica folha com desidratação varia fortemente entre as espécies (Fig. 1). Espécies sensíveis à seca experimentar um forte declínio em potenciais hídricos menos negativos do que as espécies mais tolerantes à seca, quando medido sob alta irradiância (PAR> 1.000 mmol m -2 • • s -1). A águapotencial de 80% de perda de condutividade hidráulica (P 80) para mesic erva Helianthus annuus foi de 3 MPa menos negativa do que a de Heteromeles arbutifolia, nativo da Califórnia chaparral. Heteromeles arbutifolia responderam linearmente para o declínio no potencial de água, enquanto que Helianthus annuus mostrou um não -linear declínio. Condutância estomática (g s) e condutância hidráulica folha (folha K) podem também reagir de forma dramática a irradiância (Fig. 2). Para Raphiolepis indica, a condutância estomática diminuiu fortemente com a desidratação de folhas medidos sob alta irradiância (PAR> 1.000 mmol m -2 • • s -1) e sob a luz de laboratório (PAR <6 mmol m -2 • s -1). sob alta irradiância, as folhas medido com o efm que tinha sido desidratado para potencial de água é típico bem iluminado leaves plantas intactas ao meio-dia mostrou semelhante g como medidos nas uma porômetro (estrela na fig. 2). notavelmente, hidratação máxima, k foliar foi quatro vezes maior expostas à do baixa irradiância (11 vs 2,8 -1 mpa -1) e, portanto, apresentaram resposta mais forte a luz hidratadas s. além disso, folha diminuiu fortemente desidratação. p 80 0,93 menos negativo em irradiância. figura 1. curvas hidráulicos vulnerabilidade seca sensível (em cima) e um tolerantes (inferior) partir espécies (14,24). cada ponto representa pecadomedição gle condutância hidráulica (k folha) sobre separada usando método evaporação fluxo (efm). barras verticais representam da no qual perdeu 80% inicial (p 80). melhores funções ajuste utilizando máxima verossimilhança são plotados ambas espécies. 2. estomática (g s) declínio raphiolepis indica (de 16). (par> 1.000 e <6 respectivamente.