Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623<em> Cryptosporidium</em> Ve<em> Giardia spp.</em

1. Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon Prosedürü Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: Elüsyon çözeltisi (1 L): Distile su 1 L 0,1 g sodyum polifosfat, 0.1 ml Tween-80 ve 0.01 ml Y-30 köpük eklemek için. Bir biyolojik güvenlik kabini filtre montajı (Şekil 1) hazırlayın: Bir Masterflex I / P hassas fırçasız Sürücüye bağlı bir Masterflex I / P Kolay Yük pompa kafası ile Masterflex I / P 73 laboratuvar tüp takın. Bir vidalı kelepçe ile pompa kafası upstream bir NPT şube T-konnektör takılmış 0-60 psi, gliserin dolu basıncı göstergesi tüp sabitleyin ve pompa kafası bir HDPE T-konnektör aşağı için. Bir Nalgene Masterflex L / S 15 laboratuvar boru ile 53-B dolum / havalandırma kapağı ve bir T-bağlayıcısı uyan ve 1 L Nalgene ağır polipropilen şişe sağlamca tarafından retentat şişe takılacak. Masterflex L / S 24 tüp w FitITH bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 2) ve HDPE T-konnektörüne retentat şişe bağlayın. Manometre gelen Asahi Kasei için Masterflex L / S 24 laboratuar boru bağlayın vidalı kelepçe ile 25S yüksek akılı diyalizer Rexeed ve diyalizer gelen retentat şişeye. Boş elyaf Ultrafiltreler için boru bağlamak için ¼ "ID boruları karşılamak için tasarlanmış ısmarlama DIN bağdaştırıcılarını kullanın. Bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 1) Masterflex L / S 24 laboratuvar tüp Fit ve numune alımı hattı olarak hareket etmek kaldırıldı ucu ve pamuk yumağı ile 10 ml plastik pipet bağlayın ve sonra HDPE için tüp takmak T- konektörü. Bir rampa filtrenin çıkış ucu yakınında bulunan atık noktasına hortum ve kelepçe ile bağlanmak Masterflex L/S-36 laboratuar hortumun bir ucunu takın. Atık kap içinde diğer ucu yerleştirin. % 0.01 (a / h) 10 L su örneği sodyum polifosfat ve 3 dakika boyunca karıştırılır. Tutam kelepçe 2 kapatınve retentat şişeden havalandırma kapağı çıkarın. Diğer tüm kelepçeler açık olması gerekir. Manometre (sol aşağıdaki Şekil 1 hakkı) için T-konnektör gelen sıvı taşımak için pompa yönünü ayarlayın. Maksimum hız% 25 pompa hızını ayarlayın ve pompa açın. Retentat şişenin 2/3 tam, açık tutam kelepçe 2 ve hızlı bir şekilde retentat şişe havalandırma kapağını değiştirdiğinizde. Hatları ve sızıntıların olmadığından emin olmak için bağlantı parçaları, her kontrol edin. Yavaş yavaş sızıntı kontrol, istenilen filtrasyon hızı (yaklaşık 1.5 L / dk) pompa hızını artırmak. Bir mezun silindir ve bir zaman sayacı veya akış ölçer kullanarak, atık su hattı (Şekil 1'de mavi L / S 36 tüp) ve çıkışlarında suyun süzüntü hızını kontrol edin. Hava kabarcıkları tipik olarak zor stabil bir basınç ve filtrasyon oranı elde etmek için filtre yapım çıkış ucunda oluşturabilirler. Bu, bir an için elle atık su hattı sıkıştırarak düzeltilir. Bu, eylemgenellikle süzüntü noktasına hava kabarcığı coax ve atık su hattı üzerinden çıkmak için. Bezelye büyüklüğünde hava kabarcıkları genellikle kaçınılmaz olduğunu akılda tutarak, gerektiği gibi tekrarlayın. Filtrasyon işlemi izleyin. Gerektiği gibi basınç ve filtrasyon hızını ölçün ve kaydedin. Basıncı 20 psi aşmamalıdır. Bu filtrasyon hızı 2.0 L / dk geçmemelidir önerilir. Bu retentat şişe içinde su hacmi boşaltmaktadır hiç sağlamak için izlenir olması önemlidir. Bu artırmak veya biraz azaltmak için ses seviyesi normaldir. Retentat şişede su hacmine göre 1/3 dolu düşerse, havalandırma kapağını ve yakın tutam retentat şişe hattı 2 kelepçe. Yaklaşık 2/3 geri ses getir, kelepçe açmak ve hızlı bir sızdırmazlık sağlanması, havalandırma kapağı değiştirin. Retentat şişe hacmi hızla ve sürekli düşerse, retentat şişe kapağı sıkı ve havalandırma kapağı sıkıca yerinde olduğundan emin olun ve bu tubing su numunesi ile temas halen devam etmektedir. Bu sorunları meydana değilseniz, o zaman retentat şişe kapağı içinde mühür kötü olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini muhtemeldir. Numune kabı boş olduğunda, hemen yakın tutam kelepçe 1, maksimum% 20 pompa hızını azaltmak, retentat şişeden havalandırma kapağını ve rampa kelepçe kapatın. Rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 200 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Hacminin yaklaşık 200 ml sonra, elüsyon adım (1,11-1,12) için rampa kelepçe sıkmak. Örnek kabına elüsyon çözeltisi 500 ml ilave edilir ve kabın içine durulanır. Elüsyon çözeltisi içeren bir kaba Örnek uptake hattına bağlı 10 ml pipetle yerleştirin. Rampa kelepçe kapalı olduğundan emin olun. Açık tutam 1 kelepçe ve yakın tutam elüsyon çözüm çizmek için bir an 2 kelepçe. Elüsyon çözeltisi 500 ml kadar çekilir sonraYakın, 1 kelepçe ve açık bir tutam kelepçe 2 çimdik. Elüsyon çözüm maksimum% 20 bir pompa hızı ile 5 dakika dolaşmasına izin verin. Atık su hattı üzerinde rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 100 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Rampa kelepçesini sıkın ve örnek 1 dakika dolaşmasına izin verin. Retentat şişe numune hacmi sağlayarak tüp içine hava çekerek kaçının retentat şişe giren L / S 15 tüp karşılamak için yeteri kadar yüksektir. Retentat şişeye örnek zorlar pompa yönünü tersine çevirmek. Pompa retentat şişede ~ 225 ml ve sonuç olarak toplam 20 saniye boyunca ters çalışmasına izin ver. Pompa kapatın. Pompa kafasından Masterflex I / P 73 tüp çıkarın ve manometre kesin. Boş elyaf Ultrafiltreler çıkmadan Masterflex L / S 24 tüp ayırın. Içine kalan örnek zorlamak için retentat şişe üstünde boru tutunşişe retentat. Şişeden tüm boru kesin olmayan bir havalandırma kapağı ile havalandırma kapağı değiştirin. ~ 225 ml retentat ile IMS / IFA prosedürü devam edin. 2. İmmunomanyetik Ayırma İşlemi Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: Cryptosporidium / Giardia kombo kiti oda sıcaklığına ulaşmasını: Dynabeads dahil tamponlar izin verin. 1X SL-tampon A: 10X SL-tampon A 9 ml distile su 1 ml ekleyin. Etiketli 250 ml konik santrifüj tüpüne retentat şişe sıvı ~ 225 ml aktarın. Reaktif 10 ml su ile iki kez retentat şişede, durulama ve konik bir santrifüj tüpüne durulama ekleyin. 4. 15 dakika ° hiçbir fren C için 1500 xg'de süspansiyon santrifüjleyin. Dikkatle pelet hacmi her 0.5 ml (yani aspirat 1 için hava-su arayüzünden dolu pelet yukarıdaki 5 ml supernatant aspire5 1.3 ml'lik bir hacim pelet yukarıda ml ve aspirasyon 0.5 ml veya daha az) bir pelet için 5 ml kadar. Iyice vorteks ve / veya karıştırma pipet ile süpernatan içine pelletini. 1 ml içeren düz kenarlı Dynal L10 tüpüne sıvı her 5 ml hacimde transfer A ve SL-tampon B. 10X reaktif su 2.5 ml ile iki kez konik santrifüj tüpüne yıkayın ve durulama eklemek SL-tampon 10X her tamponlar dahil olmak üzere, L10 tüpe 12 ml toplam hacme getirmek L10 tüp. L10 tüpüne 100 ul iyi karıştırılmış tekrar süspanse edilir, anti-Cryptosporidium ve anti-Giardia Dynabeads her bir ekleme. Bir rotator karıştırıcı oda sıcaklığında 1 saat 18 rpm'de L10 tüp döndürün. MPC-6 mıknatıs ve hafifçe elini kaya 2 dakika tüp uçtan uca, 180 ° karşı L10 tüpün düz tarafı yerleştirin. Mıknatıs yüzü MPC-6 mıknatıs L10 tüp tutmak kadar, boncuk / (oo) kist kompleksleri bou uzak süpernatantı boşaltacaktırmıknatısa nd. Mıknatıs gelen L10 tüpünü çıkarın ve A tüpüne 1X SL-tamponu 0.5 ml ekleyin. Dikey konumda mıknatıslı MPC-S düzenlenen bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe A SL-tampon 1X 0.5 ml iki ek durulama kullanarak süspansiyonu aktarın. Yavaşça 1 dakika MPC-S mıknatıs 180 ° tüp sallayın. Yerde mıknatıs, mikrosantrifüj borusunun alt yönelik bir Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire. Mikrosantrifüj tüpünün ön tarafına 1X PBS 1 ml ekleyin, mıknatıs kaldırmak ve boncuklar süspanse kadar sadece hafifçe tüpü sallayın. Dikey konumda mıknatıs değiştirin ve yavaşça 1 dakika tüp 180 ° sallayın. PBS mümkün olduğunca fazla enkaz olarak kaldırmak için bir Pasteur pipeti kullanarak, boncuk pelet bozmadan, durulama aspire. Mıknatıs kaldırmak ve mikrosantrifüj tüpün arka yüzüne su reaktif 50 ul ilave edin. Vorteks 50 saniye boyunca tam hızda tüp,daha sonra, bir 30 ikinci bir vorteks takiben 10 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe edilir tüpü. Mıknatısa boncuklar bağlayıcı ve sıvı içinde (oo) kistler bırakarak, eğimli bir konumda MPC-S içine mıknatıs yerini alır. Bir SingleSpot iyi slayt için (oo) kist süspansiyon uygulayın. İlk ayrışma içeren, aynı zamanda, sıvı uygulanması, adım 2.10 tekrarlanır. 37 ° C slayt iyi slayt için süspansiyon kuruması için 1 saat boyunca sıcak koyun slayt. 3. Boyama ve Sınav Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: DAPI çözeltisi çalışmaktadır: 1X PBS ile 25 ml'ye DAPI stok solüsyonu (metanol içinde 2 mg / ml) 25 ul ekleyin. Mağaza stok ve 1 ° C ve karanlıkta 10 ° C arasında çalışma çözümleri. Ayrıca sürgüye metanol 50 ul uygulamak ve oda sıcaklığında kurumaya bırakılır. Ayrıca sürgüye çalışma DAPI solüsyonu 50 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Bir Kimwi kullanınpe kuyudan DAPI fitil için. EasyStain 50 ul uygulayın. 30 dakika boyunca 35 ° C'de inkübe edilir. Bir Kimwipe ile iyi kapalı leke ve sonra yavaş yavaş iyi kenar üzerinde akmasını, soğuk EasyStain sabitleme tampon 300 ul ekleyin Wick. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Iyi olan tampon fitil ve EasyStain Montaj Orta 10 ul uygulamak için bir Kimwipe kullanın. Dikkatle oluşabilecek kabarcıkları çıkarırken, bir kapak kayma geçerlidir. Net oje ile kapak kayma sürün. Bir ookist veya kist andıran oval veya yuvarlak elma-yeşil flüoresan nesneler için, toplam 200X büyütmede, FITC filtresi kullanarak tüm slayt tarayın. Ayrıca 1000X toplam büyütmede, 1000X toplam büyütmede DAPI filtresi ile ve daha sonra DIC ile tüm bu nesneleri inceleyin. Kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ve morfolojik özellikleri kullanarak boyutu kaydedin. Belge sonuçları. Not: Ek buluOrijinal prosedürü hakkında bilgi ver-EPA Method 1623 12 Aralık 2005 sürümü bulunabilir. Açıklanan teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon prosedürü EPA Method 1623 Bölüm 12.0 yerine kullanılır. Isı ayrışma EPA Method 1623 Bölüm 13.3.3 değiştirir. Bu prosedür, aynı zamanda ilave PBS bölümü 13.3.2.16 sonra Metot 1623 Aralık 2005 versiyonu içine sokulabilmektedir IMS durulama işlemi sırasında açıklanmaktadır. Bu değişiklikler dahil olmak üzere EPA Method 1623 için kullanılan sarf malzemeleri, reaktifler ve ekipmanların tam listesi ekipman listesi yer almaktadır. 4. Temsilcisi Sonuçlar Filtrasyon ve immunomanyetik ayırma işlemleri ile telafi ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri mikroskobik inceleme ile tespit edilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi toplam 200X büyütmede, her organizmanın tipik bir boyama desen, boyut ve şekle sergileyen </strong> daha 1000X toplam büyütmede immersiyon yağı ile gözlem altında tutulmalıdır. Bu. Tipik tanımlayıcı özellikler veya olumlu kimlik ekarte olur atipik özellikler ya ölçülmesi ve tanımlanması için izin verecektir Cryptosporidium küresel nesnesine bir oval olan parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3A parlak elma yeşili FITC floresanı sergileyen çapı 4 ila 6 mikron ). Yeşil bir jant ve belirgin bir çekirdek (DAPI negatif), yoğun mavi iç boyama, veya en fazla dört ayrı, gök mavisi çekirdeklerin (DAPI ile açık mavi iç boyaması: DAPI UV ile bir ookist aşağıdaki tipik özelliği kategorilerden birini sergileyecek pozitif – Şekil 3B). Atipik özellikler renk, yapı, ya DAPI floresans (örneğin, çok lekeli çekirdekleri, kırmızı iç yapıları floresanlama) sapmalar vardır. Flüoresan nesnenin tipik FITC ve DAPI boyaması için kriterleri karşıladığı takdirde, diferansiyel girişim con kullanılarak incelenirkontrast (DIC). Nesnesi, hücre duvarı süsleme veya hücre doldurma bir veya iki büyük çekirdek gibi atipik harici veya dahili morfolojik özellikleri incelenmiştir. Atipik yapılar tespit değilseniz, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedildi ve boş bir amorf yapı olarak veya mevcut 03:59 sporozoitlerine (Şekil 3C) ile kategorize edilir. Benzer şekilde, Giardia benzeri nesneleri FITC ve DAPI boyama gibi axonemes, medyan organları ve çekirdekleri gibi DIC özellikleri yönünden incelenir Giardia kistleri ovoid elma-yeşil parlak nesneler, 8 yuvarlak -. 5 tarafından uzun 18 um – 15 mikron parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3B) ile geniş. DAPI UV ile, Giardia kist DAPI negatif boyama veya DAPI pozitif özellikleri (Şekil 3E) sergileyecek. Cryptosporidium için tarif edildiği gibi floresan nesne ile aynı şekilde, tipik ve atipik özellikler için DIC tarafından incelenmiştir.Atipik gözlenen değilse, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedilir ve boş içeren amorf yapısında olarak, ya da bu iç yapı (Şekil 3F) bir veya daha fazla türü ile sınıflandırılmaktadır. Atipik özelliklere sahip görülmektedir herhangi bir organizmanın (oo) kist olarak sayılmamalıdır. Çevre örneklerinin mikroskobik analizi otomatik floresan veya FITC-konjuge anti-Cryptosporidium ve / veya anti-Giardia antikorları 1 ile çapraz reaksiyona girebilir organizmalar olduğu gibi zor olabilir. Bir analist su mikrop ve Cryptosporidium ve Giardia belirlenmesi deneyim kazanmak için slaytlar gözden onlarca aşina olması önerilir. En az üç (oo) pozitif boyanma kontrolü slaytta kistler önce mikroskop her oturumuna karakterize edilmelidir. Kalite kontrol örneklerinde yüzde rec belirlemek için (oo) kistleri ile çivili olabilirHesaplama kullanarak her protozoon için over: (Oo) kist Yüzde Kurtarma = ((QC Örnek Sayısı – Unspiked Örnek gelen sayın) / Spike) x 100. Şekil 1. Teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon sisteminin grafik gösterimi. Tüp yardım için renk kodlu olan sistem montaj olduğunu. Şekil 2. Cryptosporidium ve Giardia (oo) kistler Temsilcisi floresan görüntü. Ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri FITC etiketli anti-Cryptosporidium / Giardia antikor ile boyandı. Oklar, Giardia kistleri, ok uçları, Cryptosporidium ookistleri. Dört Cryptosporidium ookistleri ve altı Giardia kistleri toplam odak düzlemi bulundu. Örnekleri gözlemler200X büyütme altında ed. . Karakterizasyonu için kullanılan Cryptosporidium ookistleri ve Giaridia kistlerin Şekil 3 Temsilcisi mikroskobik görüntüleri Cryptosporidium ookistleri (A – C).. Dört farklı gök mavisi DAPI çekirdekleri (B) ve oosit başına 1-4 sporozoitlerine (S) (C) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (A) çapında küresel nesneleri 4 ila 6 mikron parlak elma yeşili FITC floresans. Giardia kistleri (D – F). Ovoid nesnelere yuvarlak 8 Brilliant elma-yeşil floresans FITC – 5 tarafından uzun 18 um – dört gök mavisi DAPI çekirdek (E) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (D) ve bu tür bir veya daha fazla belirgin bir iç yapısı ile geniş 15 mikron çekirdek olarak (N), medyan gövdesi (M) ve ya axonemes (A) (F). Beyaz oklar, parlak elma yeşili floresans boyama ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri woturumlarda; beyaz ok uçları, DAPI pozitif çekirdek. Örnekler 1000X büyütme altında görülmektedir.