שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne<em> Cryptosporidium</em> ו<em> Giardia spp.</em

1. תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration נוהל הכנת מאגרים ופתרונות: Elution פתרון (1 ל '): עד 1 ליטר מים כיתה מגיב להוסיף 0.1 גרם נתרן polyphosphate, 0.1 מ"ל Tween-80 ו 0.01 מ"ל Y-30 antifoam. הכן מסנן ההרכבה (איור 1) בארון בטיחות ביולוגית: הכנס Masterflex I / P 73 צינורות המעבדה דרך הראש I / P איזי טען משאבת Masterflex מחובר כונן I / P brushless דיוק Masterflex. לאבטח את צינורות ל מד 0-60 PSI גליצרין מלא, לחץ מצויד סניף T-NPT מחבר במעלה הזרם של ראש משאבה עם מהדק בורג, וכדי טי מחבר במורד HDPE של ראש המשאבה. להרכיב את הבקבוק retentate ידי התאמת Nalgene 53-B מילוי / אוורור כובע עם צינורות Masterflex 15 L / S מעבדה T-מחבר ואבטחת אותו 1 ליטר בקבוק Nalgene חובה כבדה פוליפרופילן. התאמה Masterflex L / S 24 צינורות Wמהדק ith קמצוץ (מהדק קמצוץ 2) ולחבר אותו מבקבוק retentate כדי HDPE T-מחבר. חבר את L / S Masterflex 24 צינורות במעבדה מ מד לחץ Kasei אסאהי Rexeed 25s גבוהה השטף dialyzer עם מהדק בורג, ומן dialyzer לבקבוק retentate. השתמש מחוייט מתאמי ומחברי DIN שנועדו להכיל ¼ "צינורות מזהה לחבר את צינור חלול כדי ultrafilter סיבים. התאמה Masterflex L / S 24 צינורות במעבדה עם מהדק קמצוץ (מהדק קמצוץ 1) ולחבר אותו טפטפת פלסטיק 10 מ"ל עם פקק עצה וכותנה להסיר לפעול כקו ספיגת מדגם ולאחר מכן לצרף את צינורות HDPE טי המחבר. התאמה קצה אחד של צינור L/S-36 המעבדה Masterflex עם כבש מלחציים ולחבר את צינור ליציאת השפכים נמצא לקראת סוף היציאה של המסנן. מניחים את הקצה השני של מיכל הפסולת. הוסף 0.01% (w / v) polyphosphate נתרן מדגם 10 מים ל ומערבבים במשך 3 דקות. סגור מהדק קמצוץ 2והסר את מכסה האוורור מהבקבוק retentate. כל מהדק אחרים צריכים להיות פתוחים. לקבוע את כיוון משאבת להעביר את הנוזל מהמחבר-T ל מד לחץ (מימין לדמות הבאה שמאלה 1). להתאים את מהירות המשאבה ל 25% מהירות מקסימלית להפעיל את המשאבה. כאשר הבקבוק retentate הוא 2/3 תפס מלא, קורט פתוח 2 במהירות להחליף את כובע פורקן בקבוק retentate. בדוק את כל הקווים ואביזרים כדי להבטיח שאין נזילות. לאט לאט להגביר את מהירות המשאבה לשיעור הסינון הרצויה (כ 1.5 ליטר / דקה), בדיקת דליפות. באמצעות גליל סיים את לימודיו מטר טיימר או זרימה, לבדוק את שיעור תסנין מים היציאה מקו בשפכים (כחול L / S 36 צינורות באיור 1). בועות אוויר יכול להיווצר בדרך כלל בסוף היציאה של המסנן ולכן קשה להשיג בלחץ יציבה בשיעור סינון. זו תוקנה על ידי צובט את קו שפכים ביד לרגע. פעולה זובדרך כלל לפתות בועת אוויר לנמל תסנין וכן כדי לצאת דרך קו השפכים. חזור על פי הצורך, תוך התחשבות כי בועות אוויר בגודל אפונה הם לעתים קרובות בלתי נמנעת. לפקח על תהליך סינון. מדוד ורשום את הלחץ וקצב סינון לפי הצורך. הלחץ לא יעלה על 20 psi. מומלץ כי קצב הסינון לא יעלה על 2.0 ליטר / דקה. חשוב כי נפח המים בבקבוק retentate להיות במעקב כדי לוודא שהוא לא מרוקן. זה נורמלי נפח כדי להגדיל או להקטין מעט. אם נפח המים בבקבוק retentate יורד מתחת 1/3 מלא, ולאחר מכן להסיר את מכסה האוורור ואת קמצוץ קרוב לצבוט 2 על הקו בקבוק retentate. להביא את עוצמת הקול בחזרה בערך 2/3 מלא, פתח את תפס במהירות להחליף את מכסה האוורור, על מנת להבטיח חותם חזק. אם נפח בקבוק retentate נופל במהירות ברציפות, ולאחר מכן להבטיח את מכסה הבקבוק retentate הוא חזק מכסה האוורור הוא בבטחה במקום, וכי טוביng הוא עדיין בקשר עם המדגם מים. אם נושאים אלה לא מתרחשים, אז סביר להניח כי החותם על מכסה הבקבוק retentate רע וצריך להחליף. כאשר מיכל מדגם ריק, מהדק קמצוץ קרוב מיד 1, להפחית את מהירות המשאבה 20% המקסימלית שלה, להסיר את מכסה האוורור מהבקבוק retentate וסגור את תפס הסוללה. להתאים את עוצמת הקול של מדגם בבקבוק retentate ל כ 200 מ"ל ידי הידוק או להתרופפות מהדק הרמפה. לאחר בנפח כ 200 מ"ל, להדק את תפס הסוללה על הצעדים elution (1.11-1.12). הוסף 500 מ"ל של תמיסת elution למיכל מדגם ולשטוף את פנים המיכל. מניחים את פיפטה 10 מ"ל מחובר לקו ספיגת מדגם לתוך המיכל המכיל את הפתרון elution. ודא מהדק הרמפה סגור. קורט פתח לצבוט 1 ו 2 לצבוט צביטה קרוב לרגע להכין פתרון elution. אחרי 500 מ"ל של תמיסת elution נמשך עד, קרוב לצבוט מהדק 1 ו מהדק קמצוץ פתוח 2. אפשר פתרון elution להסתובב במשך 5 דקות במהירות משאבה של 20% לכל היותר שלו. להתאים את עוצמת הקול של מדגם בבקבוק retentate כדי מ"ל על 100 על ידי הידוק או להתרופפות מהדק הרמפה על הקו בשפכים. להדק את תפס הסוללה ולאפשר מדגם להפיץ דקה 1. למנוע משיכת אוויר לתוך צינורות ידי הבטחת נפח דגימה בבקבוק retentate גבוה מספיק כדי לכסות את L / S 15 צינורות הכניסה את הבקבוק retentate. להפוך את הכיוון של המשאבה, אשר מאלצת את המדגם לתוך הבקבוק retentate. אפשר המשאבה לפעול גם בכיוון ההפוך למשך 20 שניות וכתוצאה מכך סכום כולל של 225 מ"ל בבקבוק ~ retentate. כבה את המשאבה. הסר את I / P Masterflex 73 צינורות מהראש משאבת ונתק את מד הלחץ. נתק את L / S Masterflex 24 צינורות היציאה ultrafilter חלול סיבים. להחזיק את הבקבוק מעל צינורות retentate לכפות על כל המדגם הנותרretentate בקבוק. לנתק את כל צינורות מבקבוק ולהחליף את הכובע אוורור עם כובע לא אוורור. המשך הליך IMS / IFA עם retentate ~ 225 מ"ל. 2. ההפרדה Immunomagnetic נוהל הכנת מאגרים ופתרונות: אפשר מאגרי הכלולים Dynabeads את: Cryptosporidium / Giardia ערכת משולבת להגיע לטמפרטורת החדר. SL-1X חיץ: הוסף 1 מ"ל של 10X SL-חיץ עד 9 מ"ל מים מגיב בכיתה. מעבירים את ~ 225 מ"ל של נוזל מבקבוק retentate כדי צינור שכותרתו מ"ל 250 צנטריפוגות חרוטית. יש לשטוף את הבקבוק retentate פעמיים עם 10 מ"ל מים מגיב, ולהוסיף את שטיפות לצינור צנטריפוגות חרוטית. בצנטריפוגה ההשעיה XG ב 1500 במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם הבלם לא. בזהירות לשאוב supernatant מממשק אוויר מים עד 5 מ"ל מעל גלולה מלא עבור כל 0.5 מ"ל של נפח כדורית (aspirate כלומר עד 15 מ"ל מעל נפח כדורית של 1.3 מ"ל ו 5 מ"ל aspirate אל על גלולה של 0.5 מ"ל או פחות). יסודי resuspend גלולה לתוך supernatant ידי vortexing ו / או פיפטה ערבוב. להעביר את כל נפח 5 מ"ל של נוזל כדי צינור שטוח צדדית L10 Dynal המכילה 1 מ"ל כל אחד 10X SL-חוצץ ו 10X SL-חוצץ ב 'יש לשטוף את הצינורית צנטריפוגות חרוטי פעמיים עם 2.5 מ"ל מים מגיב ולהוסיף לשטוף את צינור L10, מביא את סך נפח מ"ל L10 צינור עד 12, כולל מאגרים. הוסף 100 μl לכל אחד גם מעורב Dynabeads נגד Cryptosporidium ואנטי Giardia resuspended לצינור L10. סובב את הצינור L10 בסל"ד 18 שעה 1 בטמפרטורת החדר על מערבל מסובבי. הנח את הצד השטוח של צינור L10 נגד מגנט MPC-6 ורוק יד בעדינות צינור מקצה לקצה, 180 מעלות במשך 2 דקות. שמירה על צינור L10 מגנט MPC-6 עם הצד מגנט למעלה, למזוג supernatant מן חרוז / (oo) מתחמי ציסטה BouND אל מגנט. הסר את הצינור L10 מן מגנט ומוסיפים 0.5 מ"ל של 1X SL-חיץ אל הצינור. מעבירים את ההשעיה באמצעות שתי שטיפות נוספות של 0.5 מ"ל של 1X SL-חיץ לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל שנערך MPC-S עם מגנט במצב אנכי. בעדינות לטלטל את הצינורית ° MPC-S מגנט 180 לדקה 1. עם מגנט במקום, לשאוב supernatant באמצעות פיפטה פסטר מכוון אל החלק התחתון של הצינור microcentrifuge. הוסף 1 מ"ל של 1X PBS לצד הקדמי של הצינור microcentrifuge, להסיר את המגנט ואת לטלטל את הצינור בעדינות רק עד חרוזים הם resuspended. החלף את המגנט במצב אנכי בעדינות רוק ° 180 צינורית דקה 1. Aspirate PBS לשטוף, מבלי להפריע את הכדור ביד, בעזרת פיפטה פסטר להסיר כמו שברים רבים ככל האפשר. הסר את המגנט ולהוסיף 50 μl מים מגיב לצד האחורי של הצינור microcentrifuge. המערבולת צינור במלוא המהירות ל -50 שניות,ואז דגירה צינור ב 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ואחריו מערבולת 2 30. החלף את המגנט לתוך MPC-S במצב משופע, מחייב את החרוזים על מגנט ולהשאיר את (OO) ציסטות בנוזל. החל את ההשעיה (OO) ציסטה לשקופית SingleSpot היטב. חזור על שלב 2.10, החלת נוזל המכיל גם אותו ניתוק 1. במקום שקופיות על 37 ° C שקופיות חם במשך שעה 1 לייבש את ההשעיה לשקופית היטב. 3. צביעה ובדיקה הכנת מאגרים ופתרונות: עבודה פתרון DAPI: הוסף 25 μl של פתרון המניות DAPI (2 מ"ג / מ"ל ​​מתנול) ל 25 מ"ל של 1X PBS. חנות מניות פתרונות העבודה בין 1 ° C, 10 ° C בחושך. החל 50 μl של מתנול לשקופית גם ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר. הוסף 50 μl של פתרון DAPI עובד לשקופית היטב דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש KimwiPE אל הפתיל DAPI מהבאר. החל 50 μl של EasyStain. דגירה על 35 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הפתיל את הכתם היטב עם Kimwipe, ואז לאט לאט להוסיף 300 μl של חיץ EasyStain קר תיקון, לאפשר לה לזרום מעבר לשפה גם כן. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש Kimwipe אל הפתיל חיץ מבאר וליישם 10 μl של בינוני EasyStain גובר. בזהירות להחיל תלוש כיסוי, הסרת כל הבועות המתרחשות. לאטום את הפתק עם כיסוי הלק ברור. לסרוק את השקופית כולה באמצעות מסנן FITC, בהגדלה של 200X כולל, עבור תפוח ירוק אובייקטים דמוי ביצה או כדורי ניאון הדומות oocyst או ציסטה. לבחון את כל האובייקטים כאלה עם מסנן DAPI בהגדלה סך 1000x ולאחר מכן עם DIC, גם בהגדלה סך 1000x. רשום את גודל באמצעות מיקרומטר עינית כיול מאפיינים מורפולוגיים. מסמך תוצאות. הערה: אינפור נוסףmation על ההליך המקורי ניתן למצוא גרסה דצמבר 2005 של שיטת EPA 1623 12. זרימת משיק חלול סיבים ultrafiltration ההליך המתואר משמש במקום סעיף 12.0 של שיטת EPA 1623. דיסוציאציה חום משנה סעיף 13.3.3 של שיטת EPA 1623. הנוהל מתאר גם PBS נוספת לשטוף בתהליך IMS שיכול להיות מוכנס לתוך הגרסה דצמבר 2005 שיטת 1623 אחרי סעיף 13.3.2.16. רשימה מלאה של מוצרי צריכה, חומרים כימיים וציוד המשמשים שיטת EPA 1623 כולל שינויים אלה מופיע ברשימת הציוד. 4. נציג תוצאות שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia התאושש באמצעות תהליכי סינון והפרדה immunomagnetic מזוהים על ידי ניתוח מיקרוסקופי. בהגדלה של 200X כולל, כל אורגניזם מפגין דפוס מכתים גודל טיפוסי, וצורתו כפי שמוצג באיור 2 </strong> יש לשים לב עוד יותר באמצעות טבילה שמן בהגדלה סך 1000x. זה יאפשר מדידה זיהוי בין אם תכונות המגדירות טיפוסי או תכונות טיפוסיות אשר שולל זיהוי חיובי. Cryptosporidium הוא דמוי ביצה לאובייקט כדורית 4 עד 6 מיקרומטר בקוטר אשר מציג הקרינה מבריק בצבע ירוק תפוח FITC בהיר עם קצוות מודגשים (איור 3 א ). עם DAPI UV, oocyst יציגו באחת מהקטגוריות הבאות תכונה אופיינית: אור צביעה פנימית כחולה עם שפה ירוקה לא ברורה גרעינים (DAPI שלילי), אינטנסיבי צביעה פנימית כחולה, או עד 4 ברורה, תכלת גרעינים (DAPI חיובי – איור 3 ב). תכונות טיפוסיות כוללות חריגות במבנה צבע, או DAPI הקרינה (למשל, גרעינים צבעונית מדי, אדום קורנים מבנים פנימיים). אם האובייקט ניאון פגש הקריטריונים FITC טיפוסי מכתים DAPI, הוא בדק באמצעות התערבות קון ההפרשtrast (DIC). האובייקט נבחן על טיפוסיות מאפיינים מורפולוגיים חיצוניים או פנימיים כמו עיטור קיר התא, או 1 או 2 גרעינים גדולים למלא את התא. אם מבנים טיפוסיים לא ציין, האובייקט נרשם מספר IFA סך לקטגוריה של מבנה אמורפי ריק או עם אחד עד ארבעה sporozoites הנוכחי (איור 3 ג). באופן דומה, Giardia דמויי אובייקטים נבדקים ביחס מכתים FITC ו DAPI כמו גם מאפיינים DIC, כמו axonemes, גופים חציון, גרעינים ציסטות Giardia עגולות על אובייקטים מבריקים בצבע ירוק תפוח ביצה, 8 -. 18 מיקרומטר ארוכות על ידי 5 – 15 מיקרומטר רחב עם קצוות מודגשים בהיר (איור 3D). עם DAPI UV, ציסטה Giardia יציגו DAPI שלילי מכתים או DAPI חיובי מאפיינים (איור 3E). אובייקט ניאון נבדק על ידי DIC עבור תכונות טיפוסית ולא טיפוסית באותו אופן כפי שתואר על Cryptosporidium.אם תכונות טיפוסיות לא ציין, האובייקט נרשם מספר IFA סך מסווג כמבנה ריק אמורפי המכילים, או עם סוג אחד או יותר של מבנים פנימיים בהווה (איור 3 ו). כל אורגניזם הוא ציין כי יש תכונות טיפוסיות אין נספר ציסטה (OO). ניתוח מיקרוסקופי של דגימות סביבתיות יכול להיות מאתגר כמו שיש יצורים שעשויים אוטומטי לזרוח או צולבות להגיב FITC-מצומדות נגד Cryptosporidium ו / או נגד Giardia נוגדנים 1. מומלץ אנליסט להכיר חיידקים ימיים ועשרות הסקירה של שקופיות כדי לצבור ניסיון לזהות Cryptosporidium ו Giardia. לפחות 3 (OO) ציסטות על השקופית מכתים חיובית השליטה צריך להיות מאופיין לפני כל פגישה על המיקרוסקופ. בקרת איכות דגימות ניתן מתובל (OO) ציסטות לקבוע rec אחוזיםאוברי protozoan עבור כל משתמש את החישוב: (Oo) אחוז ציסטה Recovery = ((לדוגמא QC Count – ספירת ממדגם Unspiked) / ספייק) x 100. באיור 1. ייצוג גרפי של מערכת זרימת משיק חלול סיבים ultrafiltration. צינורות הוא צבע מקודד לסייע היא הרכבה של המערכת. איור 2. התמונה נציג הקרינה של Cryptosporidium ו Giardia (OO) ציסטות. שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia הוכתמו FITC נגד Cryptosporidium / Giardia נוגדנים המסומנים. חצים, ציסטות Giardia, ראשי חץ, שביצים Cryptosporidium. סך של ארבעה שביצים Cryptosporidium ושישה ציסטות Giardia נמצאו המטוס של המוקד. דוגמאות observאד בהגדלה 200X. . איור 3 תמונות מיקרוסקופיות של נציג שביצים Cryptosporidium וציסטות Giaridia המשמשים לאפיון שביצים Cryptosporidium (- ג).. מבריק בצבע ירוק תפוח FITC הקרינה של עצמים כדוריים 4 עד 6 מיקרומטר בקוטר בהיר עם קצוות מודגשים (א ') המכילים עד 4 ברורה גרעינים, DAPI תכלת (ב') אחד עד ארבעה sporozoites (ים) לכל oocyst (ג). Giardia ציסטות (ד – ו). מבריק בצבע ירוק תפוח FITC הקרינה הסיבוב לאובייקטים הביצה 8 – 18 מיקרומטר ארוכות של 5 – 15 מיקרומטר רחב עם קצוות מודגשים בהיר (ד ') המכילים עד 4 גרעינים DAPI תכלת (E) עם מבנה אחד או יותר פנימי כזה ניתן להבחין כמו גרעינים (N), הגוף החציוני (M) ו – או axonemes (א) (F). חצים לבנים, מבריקים תפוחים ירוקים הקרינה צביעה שביצים Cryptosporidium ו Giardia ציסטות * פרנסותבמחזה 'כטוב בעיניכם; ראשי חץ גרעינים לבנים, DAPI חיובית. דוגמאות ציין בהגדלה 1000x.