不定冠詞<em>のin vitro</em研究する>共同感染モデル<em>熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に>-HIV-1の相互作用

注：HIV-1と熱帯熱マラリア原虫を用いた実験は、適切なバイオセーフティレベルの研究室で実行する必要があります（寄生虫のBSL2、BSL3とHIV-1と共感染症）と潜在的に感染したヒト血液を使用する場合は、特別な予防措置がとられている必要があります。 1。末梢血単核細胞（PBMC）精製（8および9に基づく） 抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、クエン酸デキストロースまたはクエン酸リン酸デキストロース）で処理した健康なドナー（500ミリリットル）から新鮮なヒト血液から始まります。 PBMCを精製単離する際にエンドトキシンフリーの試薬を使用して、プロトコルの残りの部分。 チューブを含む血液バッグを、消毒、70％エタノールで、T150フラスコに血液を移す慎重にチューブをカットします。 50 mlコニカルチューブあたり15ミリリットルリンパ球分離培地（フィコール）（フィコールが室温に達していることを確認してください）​​で16のチューブを準備します。上に新鮮な血液を注意深く層30ミリリットル。 20℃で30分間途切れるとCを400 xgで遠心します。 遠心操作中に、チューブごと室温ハンクス平衡塩溶液（HBSS）25mlで8×50 mlコニカルチューブを準備します。 慎重に HBSS（チューブあたりプール2セルリング）を含む50 mlチューブへのインタフェースで曇ったセルリング（PBMCを含む）に転送します。 HBSSで50mlにボリュームを完了します。 20℃、15分で休憩したC、150 xgで遠心します。 曇ったセルリングの遠心分離の間に、フィコール、ステップ、50 mlコニカルチューブを埋めるためにプール血漿から黄色の上位層を収集します。 ℃で30分間、1,800×gで10分間スピン56で50 mlチューブを加熱することによって、プラズマ中で補完する不活性化する。上清（後の手順では培地サプリメントとして使用することができます含まれている希釈自家血漿）を保持します。 慎重に上清とresuspenを削除50 mlチューブごとにHBSS、プール2ペレットを25mlのステップ1.7からdの細胞ペレット。 20℃で8分間300×gで遠心慎重に上清を除去し、10mlのHBSSと1つの50 mlチューブにプールにペレットを再懸濁します。 アリコートを取り、死亡率を評価し、PBMCをカウントするためにトリパンブルー排除を実行します。 HBSS、300×gでスピン10分で50mlへの完全なボリューム。上清を除去し、5×10 6細胞/ ml（1つは血液500ml中400から500×10 6 PBMCの周りに取得する必要があります）で、RPMI 1640で細胞を再懸濁します。 2。単球由来マクロファージ（MDM）分化（8および9に基づく） RPMI 1640（25ミリリットル/皿）と15cmの皿に種子約1.25×10 8 PBMC。 細胞は5％CO 2雰囲気下で37℃で1〜2時間のために付着しましょう。 新しいフラスコに、非付着細胞を移し、15 mlのエンドトキシンフリーのPBS倍（5でプレートを洗浄分、300×g）で。付着した細胞が分離した単球である。 新たに単離した単球はMDMに分化できるようにするには、5％の自家血漿（ステップ1.8から）を補充したRPMI 1640培地20mlを追加します。ヒト組換えマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、25 ng / ml）およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（PS、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン）を追加します。 2日間インキュベートし、培地を変更し、37 5％°C CO 2雰囲気下で2〜3余分な日をインキュベートします。 古い培地を除去し、エンドトキシンフリーのPBS回で洗浄し、PBSで穏やかに追加し、直ちに吸引除去する。完全に分化したMDMをデタッチするには、5％COで37℃で15〜20分間〜7ミリリットルAccutase（Accutase、プラスチック製の皿からの細胞の剥離を可能にするプロテアーゼとコラゲナーゼ活性の市販のミックス）で細胞を治療する2雰囲気下、中間時にそっと岩。 （細胞を保護するために、しばらく各プレートに3〜5ミリリットル自家血漿（ステップ1.8から）を追加）こする。 静かに培地50 mlチューブ内のすべての時間と転送/プールでのセルをカバーすることを確認して細胞をこすり取る。 できるだけ多くの細胞を回収し、エンドトキシンフリーのPBSでプレートを洗浄します。 200 xgで5分間遠心、上清を捨てる。 5ミリリットルMDM培地でペレットを再懸濁し、カウント細胞（MDMは、通常、全体のPBMC 2〜8％）を得た（RPMI 1640には10％補体不活化ウシ胎児血清（iFBS）、PS、25mMのHEPESを添加した）。注：MDMのアリコートをフローサイトメトリーにより細胞集団の純度を評価するために、この手順で実行されているかもしれません。通常の99％がMDM急行CD14を得た。 24ウェルプレートにウェルあたりMDM培地600μlの1×10 5シードMDM。 感染する前に、5％CO 2雰囲気下で37℃で一晩インキュベートします。 3。 HIV-1ウイルス株の生産と定量 HEK293T細胞folloのリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてウイルス株を生成する翼ティンらのプロトコル10。 R pHCMV-Gの+および10μg、またはNL4.3 リュック 15μgの-のいずれかNL4.3 リュック + Envの20μgのルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を含む単一サイクルウイルス、同時トランスフェクションHEK293T細胞を得るために+ ENV – R +とpJRFL envの15μgの。 +制御蛋白質欠損ウイルスを生成するためにR – NL4.3 リュック + Envの30μgを使用しています。完全に複製ウイルスについては、NL4.3Bal envの30μgを使用しています。ベクトルpHCMV-GとpJRFL envは、それぞれ、水疱性口内炎ウイルス（VSV-G）のとCXCR5指向性HIV-1（NL4.3Bal ENVとは異なる）のエンベロープ糖タンパク質をエンコードします。プラスミドの追加情報については、8から入手することができます。プラスミドは、NIHのエイズ研究とリファレンス·プログラム（NIAID、NIH）を介して取得することができます。 HIV-1 p24のキャプシドタンパク質11のELISAを使用して、すべてのウイルス株を定量化すると、使用する前にそれらの感染の可能性を確認します。我々は、TZM-BLインジケータセル12を使用して私たちのウイルス株の感染性を評価します。 4。 熱帯熱マラリア原虫の寄生虫の文化（13に基づく） 寄生虫の4.1一般的な文化とメンテナンス P.を維持する 0.5％（w / v）のAlbumax II、25μg/ mlのゲンタマイシンを添加したRPMI 1640で4％のヘマトクリット値（25mMのHEPESおよび25mM NaHCO 3でバッファリング）でヒト赤血球（血液グループO +）で熱帯熱マラリア原虫 3D7無性段階の原虫と37℃で370μMのヒポキサン​​チン窒素の1％酸素/ 5％二酸化炭素の混合ガスに°C。 寄生虫は、文化の薄層塗抹標本を作り、15％ギムザ液で染色することにより監視することができます。 寄生虫は、コントロールとして使用すると、常に同じ条件で感染赤血球（uRBC）培養皿を維持します。 後期parasitを取得するにはES（栄養型/初期のシゾント）は、次のように寄生虫を同期させます。 4.2パラサイト同期午前中に、寄生虫の文化を収穫し、300 xgで5分を回転させ、上清を捨てる。 5％（w / v）の37℃でD-ソルビトールとインキュベート5分℃で5パック細胞量のペレットを再懸濁し 300×gで5分間回転、30 mlの培養液上清、ペレットを再懸濁しを破棄し、インキュベーターに戻す。 約8時間後に、しっかりと同期して寄生虫を得るためには、手順4.2.3から4.2.1までを繰り返します。後期原虫（栄養型/初期のシゾント）は、その後の実験を実行するには、次の朝に収穫することができます。精製前に、ライフサイクルの段階を確認するために、ギムザ染色を行います。 4.3 熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（IRBC）精製 70％エタノールとpでVarioMacsセパレータ（スタンド磁石）を殺菌する生物学的なボンネットの下にレース。 CSカラムの底部に三方活栓を修正します。 ミルテニー特殊なカッター針プラスチックのプロテクターの端をカットして栓の底に針を固定してください。 慎重に磁石に列をロックします。 徐々にコックの左側にあるねじキットで囲まれたシリンジを用いて、MDM培地の10mlを注入することによって、列内のすべての気泡を除去します。 〜20ミリリットルMDM培地でカラムを洗浄します。 培養プレートから収穫RBC、10ミリリットルのMDM培地（300×gで、5分）で1回洗浄し、12ミリリットルMDM培地でRBCペレットを再懸濁します。徐々に列に追加します（栄養型またはシゾント段階で寄生虫を含む唯一の感染赤血球がhemozoin結晶の存在に起因する磁場によって保持される）を介して懸濁液の流れをみましょう。 20 mlの培地で1回洗浄し、カラムの上に白いディスクに到達したときに液体の流れを停止します。 12ミリリットルのMDM培地でクリーンな滅菌チューブに磁石と溶出IRBCから列を削除します。 塗抹標本は、回収IRBCのアリコートとライフサイクルの段階を確認するために、ギムザ染色を行います。 haemocytometer（絶縁されたRBCが100％IRBCです）を使用して回復IRBCをカウントします。 細胞をペレット化（300×gで、5分間）、上清を捨て、500μlの新鮮なAB +ヒト血清（オプソニンステップ14）で細胞を処理します。 5％CO 2雰囲気中で37℃で30分間インキュベートします。 10ミリリットルMDM培地（300×g、5分）で1回洗浄し、所望の濃度にIRBC再懸濁します。通常、10％の寄生虫血症15cmの培養皿は約〜0.5×10 8しっかり同期IRBCを提供します。 5。 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のMDMの暴露 75:1のMDM：uRBCまたはIRBCにMDMを公開するには、細胞がuRBC / IRBCの比を得るためには、MDM培地に再懸濁されている必要があります。以前にMDMを含む調製24ウェルプレートは、各ウェルに適切なRBC懸濁液のボリュームを追加します。三重のすべての実験を行う。 5％CO 2雰囲気中で37℃で4時間共培養をインキュベートします。 エンドトキシンフリーのPBSで3回、600μlで細胞を洗浄し、PBSで穏やかを追加し、直ちに吸引除去する。 残りの赤血球を溶解するために、20秒と吸引のために氷冷滅菌水200μlを添加することにより、ウェルを洗浄する。 600μlのMDM培地を追加し、5％CO 2雰囲気中で37℃で24時間インキュベートする。 6。完全に複製、HIV-1とMDMの感染 P.の効果を評価するために、 MDMのHIV-1複製に熱帯熱マラリア原虫は 、 図1A、適切なウェルにNL4.3Bal ENVウイルスのp24 10ngの（MDM培地300μLで）に概説スキームに従って、追加します。対照ウェルでのみMDM培地を追加する。 5に37℃で2時間インキュベートする％2大気のCO。 エンドトキシンフリーのPBSで3回細胞を洗浄し、PBSで穏やかを追加し、直ちに吸引除去する。ウェルあたり新鮮なMDM培地600μlを添加します。 5％CO 2雰囲気中で37℃でインキュベートします。 3日目、6、9時と12ウイルス感染の開始後、各上澄みの収穫を200μl、その後新鮮なMDM培地200μlを追加します。フォルタンら 10以下のELISA法による主要なHIV-1キャプシドP24タンパク質の定量のために-20℃で収穫された上清を保持します。 7。シングル·サイクルウイルスエンコーディングルシフェラーゼとMDMの感染 R +（ – MDMのHIV-1遺伝子発現に及ぼす寄生虫の影響を決定するために、10 ngのP24（MDM培地300μl中）NL4.3 リュック + Envのいずれかの、 図1Bで説明されている方式に従って、追加VSV-G）、NL4.3 リュック + ENV – R +（JRFL ENV）またはNL4.3 リュック +ENV – R +対応するウェルのウイルス。 5％CO 2雰囲気中で37℃で2時間インキュベートします。 エンドトキシンフリーのPBSで3回、600μlで細胞を洗浄し、PBSで穏やかを追加し、直ちに吸引除去する。ウェルあたり新鮮なMDM培地600μlを添加します。 5％CO 2雰囲気中で37℃でインキュベートします。 培地で72時間以下の感染を除去し、溶解緩衝液1X（ルシフェラーゼアッセイキットに付属）の200μlを追加します。細胞は穏やかに振盪しながら室温で溶解してみましょう。 -20℃で保存プレートを解凍し、96ウェルルミノメータープレートにライセート40μlを移し、ルシフェラーゼ基質を100μl（ルシフェラーゼアッセイキットに付属）を追加し、メーカーの指示に従って、ルミノメーターでルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ）活性を測定します。 8。代表的な結果私たちの共感染モデルを用いて、我々はそのexposurを表示P.の電子MDMへの熱帯熱マラリアは 、HIV-1感染症に対する感受性を減少させます。確かに、有意な減少（P <0.05; 2ウェイANOVA、12日目）のような上清中のHIV-1 p24のキャプシドタンパク質で測定したウイルス粒子のリリースでは、寄生虫（ 図2A）で前処理したMDMにおいて観察される。この観察は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするウイルスに感染した細胞で確認されています。外因性のVSV-GまたはHIV-1糖タンパク質のいずれかを保有するこのようなウイルスとMDMの感染は、P.に曝露した細胞で有意（p <0.05、スチューデントのt検定）未満のルシフェラーゼ生産につながる熱帯熱マラリア原虫 （ 図2B）。これは、VSV-Gシュードタイプウイルスは、そのJRFLenv対応するよりもはるかにルシフェラーゼ活性をもたらしたことは注目に値するが、これはVSV-Gシュード粒子15の大きい感染効率によるものです。寄生虫博覧会することは、ウイルスの両方のタイプのMDMへの影響に与えられ、これは、ウイルス遺伝子の元にいくつかのステップに影響を与えることを示唆している下り坂（ 図2B）。その細胞の生存率が観察さ阻害は特異的細胞の死亡によるものではないことを示す（データは示さず）IRBCにMDM博覧会の影響を受けなかった言及することも重要です。 図1。完全に複製ウイルス感染のMDM A）プレートスキームモック：非感染細胞。 uRBC：感染赤血球に暴露された細胞。 IRBC： 熱帯熱マラリア原虫感染赤血球に暴露された細胞。バル：NL4.3Bal ENVバル/ uRBCに感染した細胞：細胞はuRBCにさらされるとNL4.3Bal ENVバル/ IRBCに感染：MDM感染の IRBCとNL4.3Bal ENV Bの感染に曝露した細胞）プレート方式と単一サイクルルシフェラーゼをコードするウイルスモック：非感染細胞。 uRBC：感染赤血球に暴露された細胞。 IRBC： 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の-iに曝露した細胞nfected赤血球。 Δenv：NL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R + JRFL：NL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（JRFL ENV）。 VSV-G：NL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（VSV-G）Δenv/ uRBC：細胞uRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの-R +Δenv/ IRBCに感染：細胞はIRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した- R + JRFL / uRBC：uRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（JRFL ENV）。 JRFL / IRBC：IRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（JRFL ENV）。 vsv-g/uRBC：uRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（VSV-G）vsv-g/iRBC。細胞はIRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した- R + （VSV-G）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> 図2。 。4時間MDM）と広範囲に洗浄：A）MDM MDM のHIV-1ウイルスの生産に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の影響を比75:1（uRBC / IRBCでuRBCまたはIRBCにさらされた。細胞は2時間P24 NL4.3Bal envの10ngに感染させた。ウイルス産生は、初期のウイルス感染後の異なる時点での無細胞上清中のHIV-1 p24抗原のELISAによりモニターした。代表的な実験が示されているB）MDM MDM のHIV-1の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の効果は、ウイルス転写が比75:1（uRBC / IRBCでuRBCまたはIRBCに感染していた：MDM）。 リュック + EnvのR +（JRFL ENV）またはNL4.3 – – R +、NL4.3 リュック + ENV -細胞は、単一サイクルのウイルスのp24の10ng（いずれNL4.3 リュック + Envのに感染していたR +（VSV- g））になります。ルシフェラーゼ発現は72時間以下の初期のウイルス感染を細胞ライセートで評価した。代表的な実験が示されています。