Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.
Una gran cantidad de avances en la expresión de la comprensión genética se ha realizado utilizando sistemas di vitro. Para la mayoría de los estudios, ensayos funcionales se llevó a cabo utilizando extractos que se preparan en grandes cantidades a 10-50 o más litros de células cultivadas en suspensión. Sin embargo, estas preparaciones a gran escala no son susceptibles de prueba rápida de los efectos in vitro que resultan de una variedad de tratamientos celulares in vivo o condiciones. Este artículo de vídeo revista muestra un método para preparar funcionales pequeños extractos nucleares, utilizando células HeLa como un ejemplo. Este método se lleva a cabo utilizando tan sólo tres placas de 150 mm de las células cultivadas como monocapas adherentes. Para ilustrar la eficacia de los extractos de pequeña escala, que demostrar que son tan activos como los extractos nucleares a granel para acoplados a la RNA polimerasa II transcripción / empalme de las reacciones. Para demostrar la utilidad del protocolo extracto, se muestra que el empalme se suprime en los extractos preparados a partir de células HeLas tratados con el fármaco inhibidor de empalme E7107. El protocolo de pequeña escala deben ser aplicables a cualquier proceso o tipo de célula que puede ser investigado in vitro utilizando extractos celulares. Estas incluyen las células del paciente que sólo están disponibles en cantidades limitadas o las células expuestas a numerosos agentes como las drogas, los agentes que dañan el ADN, los ARNi, o de transfección, que requieren el uso de las poblaciones de células pequeñas. Además, pequeñas cantidades de células recién cultivadas son convenientes y / o necesario para algunas aplicaciones.
Hemos establecido un método rápido y reproducible para la preparación de extractos nucleares de pequeñas cantidades de células HeLa que crecen como monocapas. Hemos demostrado que estos extractos son robustos al mostrar que la cinética y la eficiencia de RNAP II transcripción / empalme ensayos son similares en los extractos nucleares de pequeña escala y volumen. Hemos demostrado la utilidad de los extractos mediante la demostración de que los extractos preparados a partir de células tratadas con un fármaco inhibidor de empalme son activos para la transcripción pero defectuoso en el empalme.
Nuestro método para preparar los pequeños extractos nucleares se estableció mediante la combinación y la optimización de los métodos previamente establecidos para la fabricación de extractos de células HeLa que crecen en suspensión en gran escala 1,8 y un método para la pequeña preparación de extractos 9. Se estableció el protocolo porque los anteriores pequeños extractos no eran funcionales para algunos ensayos, tales como la transcripción acoplado / splicing ensayo. Una diferencia importante entre el anterior protocolo de pequeña escala 9 y la nuestra es que hemos optimizado las condiciones para la lisis de las células utilizando un Dounce mini-mientras que el protocolo anterior se lisaron las células empujándolas a través de una pequeña aguja de calibre 9. Los resultados de lisis de agujas en las burbujas, lo cual puede explicar por qué los extractos estaban inactivos y / o difíciles de reproducir en algunos ensayos. También hemos añadido una etapa de concentración en nuestro protocolo. Este paso aumenta la actividad de los extractos, los cuales son extremadamente sensibles a la concentración, y también limita la variabilidad entre los extractos que es inherente a pequeña escala preparaciones. Finalmente, nuestra preparación se lleva a cabo habitualmente con sólo tres placas de 150 mm de monocapa de células, sin ningún efecto significativo sobre la actividad frente a los extractos de a granel. Por lo tanto, el procedimiento es que se presta fácilmente a los pequeños preparados que requieren reactivos costosos o la disponibilidad limitada de células. Por ejemplo, hemos preparado SMAll escala extractos de células RNAi desmontables y de una leucemia linfática crónica (LLC paciente), y utilizar estos extractos para los ensayos funcionales y / o bioquímicos (EGF, JLH, TY y RR, inédito). Hemos encontrado que los extractos son valiosos para RNAi seguido por ensayos bioquímicos específicos, tales como immunopreciptations, western y tinción de plata. Después de establecer la eficacia de abatir una proteína particular, un estudio más detallado puede llevarse a cabo haciendo una caída estable línea celular, que puede ser utilizada para preparar extractos adicionales a menor costo. La espectrometría de masas de las proteínas presentes en inmunoprecipitados obtenidos a partir de estas líneas celulares desmontables también será una aplicación útil del método. Además de la transcripción acoplado / empalme ensayo que se utilizó como un ejemplo para nuestra descripción protocolo aquí, los extractos de pequeña escala debe ser aplicable en general a numerosos ensayos funcionales y bioquímicas, tales como los utilizados para el pt diferenteeps en la expresión génica (por ejemplo, nivelación, el empalme, la transcripción, poliadenilación, procesamiento de microARN). El protocolo también puede adaptarse para tipos de células del paciente que pueden ser obtenidos ya sea en suspensión (tal como las células CLL) o en cultivos (tales como los fibroblastos del paciente). Finalmente, la fracción citoplásmica obtenida durante el procedimiento debería ser útil para ensayos funcionales y bioquímicas que requieren el citoplasma.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos al señor Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng útil para los debates. Las células HeLa fueron obtenidos de la célula Nacional Culture Center (Minneapolis, MN). Agradecemos también a Eisai Co., Ltd. para proporcionar E7107 y el Centro de Nikon Imaging en Harvard Medical School en busca de ayuda con microscopía de luz. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH GM043375 a RR y el EGF y el compañerismo NRSA a JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.