JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

NADH Fluorescence הדמיה של Biventricular מבודדת עבודה לבבות ארנב

Published: July 24, 2012
doi:
10.3791/4115
, , , ,
1Electrical and Computer Engineering Department,The George Washington University, 2Pharmacology and Physiology Department,The George Washington University

Summary

המטרה היא לפקח על המדינה חמזור המיטוכונדריה של לבבות בודדים בהקשר של preload פיזיולוגי ולחצים afterload. הלב biventricular לעבוד במודל ארנבת מוצג. רזולוציה גבוהה spatiotemporal הקרינה הדמיה של NADH משמש כדי לפקח על מצב חמזור המיטוכונדריה של הרקמה epicardial.

Abstract

מאז הקמתה על ידי Langendorff 1, הלב נשאר בודד perfused כלי מרכזי ללימוד פיזיולוגיה של הלב 2. עם זאת, זה לא מתאים היטב מחקרים של חילוף החומרים של הלב, אשר דורשים הלב לבצע את העבודה בהקשר של preload פיזיולוגי ולחצים afterload. שינויים שהוכנסו ונילי לטכניקה Langendorff להקים המתאים חדר שמאל (LV) preload ולחצים afterload 3. המודל נקרא מודל מבודד בלב עבודה LV נעשה שימוש נרחב על מנת ללמוד את ביצועי LV ומטבוליזם 4-6. מודל זה, לעומת זאת, אינו מספק החדר הימני טעון כראוי (RV). Demmy et al. 1 דיווח מודל biventricular כמו שינוי של המודל LV הלב עובד 7, 8. הם מצאו כי פיתוח נפח הפעימה, תפוקת הלב, ולחץ משופרת בלב המרה ממצב למצב LV עובד עובד biventricular 8 </sup>. RV נטען כהלכה גם מפחית מפל הלחץ לא תקינים על פני מחצה כדי לשפר את תפקוד במחיצה. לבבות עבודה Biventricular הוכחו לשמור על התפוקה אבי העורקים, זרימה ריאתי, אומר אבי העורקים בלחץ, קצב לב, שריר הלב רמות ה-ATP עד 3 שעות 8.

כאשר לומדים את ההשפעות המטבוליות של פגיעה בשריר הלב, כגון איסכמיה, לעתים קרובות יש צורך לזהות את המיקום של הרקמה הפגועה. ניתן לעשות זאת על ידי הדמיה הקרינה של NADH (בצורה מופחתת של dinucleotide אדנין nicotinamide) 9-11, מצאו אנזים בכמויות גדולות במיטוכונדריה. NADH הקרינה (fNADH) מציג יחס הפוך באופן ליניארי ליד עם 12 חמצן בריכוז המקומי ומספקת מידה של המדינה חמזור המיטוכונדריה 13. הדמיה fNADH בתנאים hypoxic ו איסכמי שימש שיטת צבע ללא לזהות אזורים hypoxic 14, 15 ו לעקוב אחר התקדמותבתנאי חוסר חמצן לאורך זמן 10.

מטרת השיטה היא לעקוב אחר מצב חמזור המיטוכונדריה של לבבות עבודה biventricular במהלך פרוטוקולים המשנים את קצב חילוף החומרים myocyte או לגרום היפוקסיה או ליצור שילוב של השניים. לבבות מניו זילנד ארנבים לבנים היו מחוברים למערכת הלב biventricular עובד (הוגו זקס Elektronik) ו perfused פתרון קרבס-Henseleit שונה 16 ב 37 ° C. אבי העורקים, LV, עורק הריאה, ולחצים פרוזדורי & שמאל ימין נרשמו. הפעילות החשמלית נמדדה באמצעות אלקטרודה monophasic פוטנציאל פעולה. לתמונה fNADH, האור של מנורת כספית לא מסונן (350 ± 25 nm) ולהשתמש בהם כדי להאיר את epicardium. האור הנפלט היה מסונן (460 ± 20 ננומטר) צילמו באמצעות מצלמת CCD. שינויים fNADH epicardial הלבבות עבודה biventricular במהלך שיעורי צעדה שונים מוצגים. שילוב של מודל לב fNADH הדמיהמספק כלי ניסיוני חדש ובעל ערך לחקר מחלות לב חריפה בהקשר של תנאים פיסיולוגיים מציאותיים.

Protocol

1. הגדרת לחקר הכינו ארבעה ליטרים של פתרון קרבס-Henseleit שונה (16 מ"מ: 118 NaCl, KCl 3.30, 2.00 CaCl 2, 1.20 MgSO 4, 24.0 NaHCO 3, 1.20 KH 2 PO 4, 10.0 גלוקוז, 2.00 NaPyruvate, ו 20.0 מ"ג / ל 'אלבומין ). הפתרון צריך להיות מוכנים הכי קרוב לתחילת הניסוי ככל האפשר. ה-pH צריך להיות מותאם 7.4 לאחר סינון סטריליים (גודל הנקבוביות: 22 מיקרומטר, קורנינג). Osmolality הפתרון צריך להיות בין 275 לבין 295 mOsm / ק"ג. יש לשטוף את כל צינורות ותאי של מערכת הלב לעבוד עם מים מטוהרים. להפעיל משאבות עד שכל המים הוסר מהמערכת. הוסף קרום תאית מסננים (גודל הנקבוביות: 5 מיקרומטר, Advantec) בקו אחד עם של משאבות זלוף (משאבת Langendorff זלוף, המשאבה השמאלית זלוף לב, המשאבה הימנית זלוף לב). לבצע כיול 2 נקודות (0 ו 60 מ"מ כספית) עבור כל חיישן לחץ. הפעל את אמבטיות המים. האמבטיה מחוממת מים במחזור (קול פאלמר) משמש כדי לחמם את המים במעילים צינורות מחליפי חום. Perfusate הוא מראש חימם באמבט מים נפרד (Oakton מכשירים). אמבטיות הן מוגדרות כדי לשמור על טמפרטורה פתרון של 37 ° C. להפעיל את המשאבות להפיץ perfusate בלולאה סגורה. Perfusate עובר oxygenators Microfiber (hemofilters) בגז עם 95% O 2 ו – 5% CO 2 ב kPa 80. Perfusate מחומצן מכן זורם דרך מחליפי חום לשמור אותו בטמפרטורה של 37 מעלות לפני הכניסה cannulae לב. 2. לב כריתת להתחיל על ידי קביעת מערכת הלב עובד לפעול במצב לחץ מתמיד Langendorff. הגדר את הלחץ של גוש אבי העורקים בטווח של 50-60 מ"מ כספית. להרדים את הארנב עם זריקה תוך שרירית של קטמין (44 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). אחרי הארנב הוא מסומם, pentobarbital (50 מ"ג / Kז) וכן הפרין (2000 U) מוזרק לווריד דרך הווריד האוזן שולית או וריד saphenous לרוחב בחלק הפנימי של הגפיים האחוריות. כאשר הארנב הוא לחלוטין לא מגיב, כפי שנקבע על ידי חוסר כאב רפלקס, חלל בית החזה נפתח במהירות, קרום הלב הוא פרוס, אבי העורקים הוא הידק, ואת הלב והריאות נכרת. בשלב זה הריאות יש להשאיר מחוברת ללב לסייע לבודד את הוורידים ריאתי. לבודד cannulate אבי העורקים עם צינורית בקוטר 5 מ"מ המחובר מזרק מלא perfusate 60 מ"ל ו -200 יחידות של הפרין. להבטיח את אבי העורקים אל צינורית עם תפר אפס משי לאט לדכא את המזרק כדי לשטוף את הלב של דם. 3. Biventricular Cannulation חבר את הלב כדי לחסום אבי העורקים של מערכת הלב עובד. למנוע כניסת אוויר אבי העורקים, שעלולה לגרום תסחיפים כלילית. מומלץ לצרף את צינורית כדי BL אבי העורקיםock ידי מתקרבת המחבר אבי העורקים בזווית אלכסונית ומאפשר perfusate בעדינות כדי לטפטף מהמחבר לתוך צינורית בזמן שהוא מחובר. בעוד הלב perfused במצב לחץ מתמיד Langendorff, להסיר את רקמת השומן ואת החיבור לאתר את כלי הבאים: נחות מעולה הווריד הנבוב, וריד azygos, עורק הריאה, ורידים ריאתי. ולקשור מעולה הווריד הנבוב. חותכים את עורק הריאה ממש מתחת למקום שבו סניפים אל עורקי הריאה הימנית והשמאלית. קבוצת כל כלי הנותרים (הוורידים ריאתי) בין הלב והריאות לבין ולקשור את כולם באמצעות אחד תפר. הסר את הריאות. חותכים חור קטן בפינת תוספת פרוזדורים שמאל. ודא LA מלא perfusate. Cannulate LA תוך הקפדה כי צינורית מלא לחלוטין עם perfusate כאשר הוא מוכנס. לתפור את הצינורית תוספת LA. הפעל את המשאבה בצד שמאל (משאבה # 2) כדי לספק זרימה לאהוא עזב את אטריום. הגדרת הלחץ preload בין 2-6 מ"מ כספית ולהתאים ± 2 מ"מ כספית, כפי שנקבע על ידי התרחבות פרוזדורים. מעבר לב למצב הלב לעבוד ידי כיבוי המשאבה Langendorff (משאבת # 1). לרגע להקטין את הלחץ על העורקים mmHg 10 ואז לאט לאט להגביר את זה בטווח של 80-100 מ"מ כספית. זה יאפשר שסתום אבי העורקים כדי לפתוח לתפקד כפי שהוא היה בתנאים פיזיולוגיים רגילים. לחץ afterload הסופי יהיה תלוי contractility של LV. יש להגדיר ערך זה הוא כ 20 מ"מ כספית בלחץ פחות מ LV שיא. תפוקת הלב LV ניתן לקבוע על ידי מדידת קצב זרימה של perfusate היציאה בלוק אבי העורקים (mL / min). תפוקת לב נורמלית היא בין 14.77 לבין 16.43 mL / min ל -100 גר 'משקל גוף 17 והממוצעים 340 mL / min לארנב 2.2 ק"ג. לחץ אבי העורקים צריכה להיות דומה האות ללחץ שמוצג באיור 1. Cannulate RA דרך אניnferior הווריד הנבוב. להבטיח כי הן את RA ואת הצינורית מלאים לחלוטין עם perfusate ולהכניס צינורית תוך מניעת היווצרות של בועות אוויר. לתפור צינורית אל הווריד. הפעל את המשאבה בצד ימין (משאבת # 3) כדי לספק זרימה אטריום הנכון. הגדר את הלחץ מ"מ כספית לכ 3. ודא RV מלא perfusate ו cannulate עורק הריאה. ודא צינורית מלא לחלוטין עם perfusate בזמן שהוא מוכנס כדי למנוע בועות אוויר. לתפור צינורית אל עורק הריאה. 4. רכישת אות: לחצים, פוטנציאל פעולה monophasic ו fNADH לאחר cannulation biventricular הושלמה, בזהירות להכניס את מתמר הלחץ קטטר (מילר) אל אבי העורקים דרך צינורית אבי העורקים. בעדינות לנווט את זה בעבר שסתום אבי העורקים אל LV. מעקב אחר אותות הלחץ LV על מנת להבטיח מיקום נכון של קצה הצנתר. למשל הלחץ LV מוצגבאיור 1. לחץ בעדינות את האלקטרודה monophasic פוטנציאל לפעול נגד epicardium חדרית. לפקח על האות כדי להשיג המתאימים פוטנציאליים מדידות פעולה. חפץ בתנועה קלה אות נורמלי. מניחים אלקטרודות גירוי דו קוטבית על אטריום את הזכות לצעוד לב. בפרוטוקול שלנו, היו בקצב הלב על אורך מחזור בין 300 ל 150 אלפיות השניה, המייצגים 200 ל 400 פעימות לדקה, בהתאמה. למדוד את הטמפרטורה של פני השטח LV epicardial. אם המחקר מחייב להישמר בטמפרטורת 37 מעלות צלזיוס ואז למקם את הלב בתוך חדר מים במקטורן לב או להטביע את הלב באמבטיה superfusate מחומם כדי לשמור על טמפרטורה קבועה לאורך כל הלב. מקם את המצלמה CCD (אנדור iXon DV860, 128×128 פיקסלים) ולמקד את העדשה כך בשדה המתאים המבט הוא ציין. המצלמה מחוברת עבודה ותמונות נרכשים על 2 fps באמצעות אנדור סוליס Softwaמחדש. להדליק את האור מנורת כספית לפני תחילת ההדמיה. אור מכוונת דרך פילטר עירור (350 ± 25 ננומטר, טכנולוגיה Chroma) אל תוך ספר אור בסיבים אופטיים (HORIBA Jobin Yvon מודל 1950-1M) כדי להאיר את פני השטח של הלב. הנחתה של אור UV באמצעות מדריך אור קטן. תאורה UV יכול גם להינתן באמצעות מערכת החשמל גבוהה LED המורכבת זרקורים LED (Mightex PLS-0365-030-S) ו יחידת בקרה (Mightex SLC-SA04-US). לכבות את האור בחדר ולמזער כל תאורת הסביבה. לכוון את מתנוצץ בחישוקי המתכת של מדריך אור (או זרקורים-LED) בלב להשיג תאורה epicardial אחיד. הקרינה הנפלטת NADH (fNADH) עובר דרך מסנן הפליטה (460 ± 20 nm טכנולוגיה Chroma) והוא צילמו במצלמת CCD. לעקוב אחר שינויים fNADH לאורך זמן על ידי בחירת אזור של אינטרס באמצעות תוכנת הדמיה. בחר לחיות עדכון מצב לנטר את עוצמת פיקסל הממוצע בתוך O באזורF עניין. בלב יש לפעול במצב עבודה biventricular ליצור לחצים המתאימים. רמות fNADH צריכה להיות נמוכה ויציבה על פני epicardial לאשר זלוף כלילית הולם. בשלב זה של המחקר פרוטוקול הניסוי הספציפי צריך להיות מיושם כדי לבחון השערה. כאשר המחקר תושלם, להסיר את הלב מן המערכת ולנקז את כל perfusate. יש לשטוף את צינור מערכת לתאי עם מים מטוהרים. עבור תחזוקה שוטפת, המערכת יש לשטוף מדי פעם עם פתרון Mucasol או מימן מדולל חמצן הפתרון, לפי הצורך. 5. לא מקוון עיבוד תמונות fNADH אחת הדרכים להשוות בין מערכי נתונים NADH (fNADH (i, j, t)) בין הניסויים הוא לנרמל את כל התמונה הקרינה באמצעות תמונה התייחסות (fNADH (i, j, t 0)) של בסיס הנתונים 9, כפי שניתן לראות במשוואה הבאה . דרך נוספת לנרמל NADH הקרינה היא PLאייס פיסה קטנה של זכוכית uranyl בתחום של תצוגה לפני הניסוי 9, 18, ​​19. זכוכית Uranyl יהיה הקרינה (450-550 ננומטר) כאשר מואר עם האור האולטרה סגול לספק אות שניתן להשתמש בהם כנקודת התייחסות יציבה. 6. נציג תוצאות צפיות הקדמי ואת הבסיס של הכנת הלב biventricular עובד ארנב מוצגות באיור 1. הלחץ חדר שמאל נמדד על ידי ניווט מתמר לחץ קטטר (מילר SPR-407) בעבר שסתום אבי העורקים לתוך החדר השמאלי. , אבי העורקים בעורקי הריאה, ועל שמאל לחצים חדרית (LVP) מוצגים בתרשים 1 ג. LVP הדיאסטולי הוא בדרך כלל בין 0 ל 10 מ"מ כספית. הלחץ הדיאסטולי מינימום אבי העורקים הוא כ 60 מ"מ כספית. שיא הסיסטולי LVP תלוי בלחץ מילוי (preload או לחץ LA) ו contractilityוכן, בצורה אופטימלית, צריך להיות בין 80 ל 100 מ"מ כספית. אבי העורקים הלחץ המרבי ומקסימום LVP צריך להתאים באופן הדוק, כפי שמוצג באיור 1 ג. פוטנציאל פעולה monophasic (מפות) עם שלב שלילת קוטביות מהירה בשלב repolarization האופייניים של לבבות ארנב מוצגים 1D איור. מפות ניתן להקליט בקלות יחסית מהלב מתקשרת אבל בדרך כלל יש חפץ בתנועה קטנה במהלך דיאסטולה, כפי שמוצג באיור 1D. מפות שימושיים המאשר entrainment מוצלח של הלב (לכידה) במהלך צעדה והוא יכול לשמש גם כדי למדוד שינויים אלקטרו המקומיים עקב איסכמיה חריפה או הפרעות אחרות. א.ק.ג. יכולה גם להימדד על ידי הצללה בלב באמבט של superfusate חם הצבת אלקטרודה באמבטיה על צד ימין וצד שמאל של הלב. האלקטרודה אדישים 3 ממוקמת גם באמבטיה, הרחק מן הלב, או מצורף אבי העורקים.א.ק.ג. יספק מידע על עירור העולמי תהליך repolarization, וזה שימושי להערכת תפקוד החשמל הכוללת לגילוי נוכחות של איסכמיה. fNADH הדמיה מגלה שינויים במצב חמזור המיטוכונדריה של הלב, אשר ניתן להשתמש בהם כדי למדוד את התקדמות spatiotemporal של אזורים איסכמיים או חוסר חמצן. לצורך המחקר, epicardial fNADH נמדדה לעקוב אחר השינויים במצב חיזור במהלך שלושה שיעורי צעדה על אורך מחזור (CLS) של 300, 200, 150 אלפיות השניה. ממוצע ערכי fNADH מאזור עניין (תיבה אדומה, איור 2) מראות כי רמות הבסיס fNADH להגדיל ככל אורך המחזור מתקצר. כאשר לצעוד בקצב קרוב לקצב סינוס (CL = 300 msec) בבסיס רמת fNADH הוא קבוע יחסית. כמו אורך המחזור מתקצר מתחת 300 אלפיות השניה, המחקר עלייה fNADH רמות, עם העלייה הגדולה ביותר ב CL הקצר ביותר (150 אלפיות השניה). רזולוציה גבוהה fNADH הדמיה של פני השטח הקדמי מלאב 200 ו 400 BPM מוצגת באיור 3. רמות fNADH ב 200 BPM היו מתמיד הומוגני מרחבית. ב 400 BPM, רמות fNADH גדל באופן משמעותי לאורך epicardium. ההטרוגניות המרחבית משמעותית נצפתה עם העלייה הגדולים המתרחשים בתוך האזורים במחיצה הבין של RV ו LV. האות fNADH נעה עם התכווצות (חפץ בתנועה) ותדירות תנודה מתאים בקצב הלב (איור 2). ב cannulation biventricular, בבסיס הלב מוחזק על ידי 4 cannulae, אשר מסייע למנוע מן הלב מתנדנד במהלך התכווצות. לכן, משרעת תנודה הוא תמיד פחות מ קנה מידה זמן רב יותר (5-10 שניות) מגמות fNADH הנגרמים על ידי איסכמיה או היפוקסיה. באיור 1. הלחצים טיפוסי פוטנציאל פעולה monophasic מ biventricular מבודד עובד rabbit לב. תצוגת א בסל של הלב מראה cannulae 4: 1, אבי העורקים, 2, עורק הריאה, 3, עזב פרוזדורים, ו 4, פרוזדורים הזכות צפה ב הקדמי של הלב מראה החדר השמאלי (LV) ואת החדר הימני. (RV). ג נציג לחצים. למעלה: הלחץ חדר שמאל (קו מוצק) ואת הלחץ של אבי העורקים (קו מקווקו). למטה: לחץ ריאתי. ד מייצגים פוטנציאל פעולה monophasic. אות מיושר עם הלחצים המוצגים בלוח ג לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה . איור 2. fNADH הדמיה של biventricular מבודד עובד לב שפן. למעלה: קריקטורה של שדה הראייה (משמאל) שלוש תמונות fNADH מוצגים. צעדה המקביל מחזור אורך (CL) מצוין על כל תמונה.האזור של עניין לאות fNADH בלוח התחתון מצוין באמצעות תיבת אדום. קצה האלקטרודה פעולה monophasic הפוטנציאל נראה בצד ימין של האזור של עניין. Epicardium היה מואר באמצעות מנורת כספית ספר אור, כפי שמוצג באיור 5. רק את פני השטח epicardial סביב האזור של עניין היה מואר התחתונה:. FNADH ממוצע לאזור עניין מצוין באמצעות תיבת אדומה בלוח העליון. ממוצע fNADH עולה עם אורך מחזור מופחת. איור 3. fNADH תמונות של פני השטח הקדמי מלא biventricular מבודד עובד לב שפן. הלב היה בקצב של RA ב 200 BPM ו – 400 פעימות לדקה. fNADH היה צילמו (2 fps, 128×128 פיקסלים ברזולוציה של 0.4 מ"מ) תוך הארת epicardium הקדמי כולו באמצעות 2 נוריות מתח גבוה (Mightex PLS למוצרי 0365-030-S, 365 ננומטר, 4% intensity, 50 mW Max).

Discussion

הלב נשאר בודד Langendorff perfused כלי בולט לחקר הפיזיולוגיה לב 2. זה שימושי במיוחד מחקרים על הפרעות בקצב הלב, במיוחד אלה להשתמש דימות פלואורסצנטי פוטנציאל הטרנסממברני 20. היתרון הוא epicardium כל הלב בודד ניתן לראות 21, 22. יתרון נוסף הוא, בניגוד הדם, זלוף עם פתרון גבישן ברור חיץ לא להפריע אותות הקרינה. המגבלה היא טכניקה Langendorff לא מתאימים ללימודים של חילוף החומרים לב, אשר לעיתים קרובות דורשים הלב לבצע את העבודה בהקשר של preload פיזיולוגי ולחצים afterload.

כדי להעלות את הרלוונטיות של ההכנות לב מבודדים ללימודי מטבוליות, הציג ונילי שינויים טכניקה Langendorff להקים המתאים חדר שמאל (LV) preload ולחצים afterload 3.המודל נקרא מודל מבודד בלב עבודה LV נעשה שימוש נרחב על מנת ללמוד את ביצועי LV ומטבוליזם 4-6. מודל עבודה LV לב עדיפה על מודל Langendorff על הערכות תפקודית, אך הוא אינו מספק החדר הימני טעון כראוי (RV). Demmy et al. 1 דיווח מודל biventricular (LV & RV), כמו שינוי של המודל LV הלב עובד 7, 8. הם מצאו כי פיתוח נפח הפעימה, תפוקת הלב, ולחץ משופרת בלב המרה ממצב למצב LV עובד עובד biventricular 8. RV נטען כהלכה גם משפר את התפקוד במחיצה על ידי צמצום מפל הלחץ לא תקינים על פני מחצה. לבבות עבודה Biventricular הוכחו לשמור על התפוקה אבי העורקים, זרימה ריאתי, כלומר הלחץ אבי העורקים, כלומר לחץ ריאתי, קצב הלב ואת שריר הלב ATP, קריאטין פוספט רמות של עד 3 שעות 8. מחקרים Biventricular לב העובדים משתמשים בדרך כלל לבבות frאום חיות קטנות, כמו עכברים וארנבים, כי תפוקת הלב לבין נפח הנדרש perfusate הרבה פחות מזה על ליבם של בעלי חיים גדולים יותר. עם זאת, מחקרים biventricular לב העבודה נערכו באמצעות לבבות בין חזירים, כלבים, ואפילו בני אדם 23, 24.

הדרישה המטבולית של לבבות בודדים במצב עבודה biventricular גבוה במידה ניכרת מזה של זלוף Langendorff. חשוב שהפתרון perfusate לספק מספיק חמצן ואת המצע חילוף החומרים לתמוך תפקוד הלב biventricular. פתרונות סטנדרטיים גבישן חיץ, כגון קרבס-Henseleit 16, 17, 25 או Tyrodes 26, 27, יש solubilities חמצן גבוה ככל 5.6 מ"ג / ל ' כאשר אלה הם פתרונות בגז עם carbogen (תערובת גז של 95% O 2 ו – 5% CO 2) ומכילים המצע חילוף החומרים (גלוקוז, דקסטרוז, ו / או פירובט נתרן) מתאים, הם מתאימים לבבות עבודה biventricular מכים על הנורמהבאל בסינוסים שיעורי (כ 180 BPM עבור ארנב).

הביקוש גדל חילוף החומרים של מקצבים מהירים וכמות החמצן המומס perfusates רגיל לא יכול להיות מספיק כדי תמיכה מלאה הלב עובד biventricular כי היא מתקשרת בשיעורים גבוהים. פתרונות גבישן חיץ המכילים אריתרוציטים או מעורבים עם דם מלא שימשו ההכנות לב העובדים על מנת להבטיח זמינות חמצן נאותה. מחקרים קודמים הראו כי הוספת אריתרוציטים לפתרון קרבס-Henseleit שיפור תפקוד הלב עובד במהלך פרוטוקולים צעדה מחמירות וכן להפחית את השכיחות של פרפור חדרים 16. הגבלה של שימוש אריתרוציטים או תערובות של דם מלא הוא המוגלובין מפריע אורכי גל האור המשמשים הקרינה הדמיה 13. מצעים אחרים, כמו אלבומין, ניתן גם להוסיף פתרונות perfusate להאריך את הכדאיות לב להפחית בצקת 28.

במהלך דימות פלואורסצנטי עוצמת האור עירור צריך להיות גבוה חלוקת האור צריך להיות אחיד. להשיג תאורה אחידה לא תמיד קל בגלל העקמומיות של פני השטח epicardial. במחקרים שלנו, אנחנו התמונה fNADH ידי סינון אור (350 ± 25 nm) של מנורת כספית. סיבים אופטיים מפוצלת ספר אור משמש כדי לכוון את אור UV על פני השטח epicardial. תאורה אחידה יכולה להיות מושגת על ידי מיקום מתאים שני מתנוצץ בחישוקי המתכת פלט. UV-LED מקורות אור יכול לשמש גם, כפי שכבר הוכיח באיור 3. מקורות LED הם זולים יחסית כך ממקורות מרובים יכול להיות משולב בתוך מערכת הדמיה. נוריות ניתן גם באופניים לסירוגין בשיעורים גבוהים לסנכרן אור עירור עם רכישת התמונה.

Photobleaching של NADH צריך להיות ממוזער 29 על ידי הקטנת הזמן של הארה רקמות. זה יכול להיעשות על ידי רכיבה על אופניים הארה לסירוגין באמצעות אלקטרוניםIC התריס המנורה או עם מערכת תאורת LED לבין בקר. אם התאורה מסונכרן עם מחזור לב, אז רכישת התמונה fNADH יכול להיות מוגבל תרויח, אשר יפחית את החפץ תנועה אותות הקרינה. תאורה Trigging ורכישת התמונה באמצעות אותות הלחץ, כגון לחץ LV, תהיה דרך אחת לעשות את זה.

במחקרים שלנו ראינו כי שינויים fNADH ליחידת זמן יכול להיות יותר מ 5X ב 400 BPM גבוה יותר מאשר ב 200 BPM. זה מצביע על כך מקצבים מהירים לרומם את מצב חיזור של הלב. אם זה נגרם על ידי היפוקסיה או חוסר היכולת של מיוציטים לחמצן NADH ל NAD + מספיק מהר כדי למנוע הצטברות של NADH עדיין השאלה ללא מענה.

הביצועים של הכנת הלב biventricular עבודה מותנית בגורמים רבים. אחד החשובים ביותר הוא להגדיר המתאימים לחצים preload ו afterload לחקות פיזיולוגיתתנאים הנמצאים תחת חקירה. בפרט, afterload LV (לחץ אבי העורקים) חייב להיות מותאם לייצג בלחץ מערכתי. אם הוא גבוה מדי, LV לא יוכלו להתגבר על הלחץ, וכתוצאה מכך regurgitation. הלחץ נמוך מדי יפגע זלוף כלילית. לחץ preload LV (לחץ פרוזדורים משמאל) צריך גם להיות מותאם לספק נפח דיאסטולי סוף שמתאימה פרוטוקול הניסוי.

fNADH הדמיה של רקמות חיות הוא מצב מבוססת הדמיה של הקרינה 13. ויישומו ברקמת הלב הודגם בארלו סיכוי כאשר הם דיווחו על עליות מרשים של fNADH בתוך רקמת איסכמי אזורית לאחר קשירת 14 כלי כלילית. תמונות fNADH שלהם נרשמו על הסרט באמצעות מצלמה אוסצילוסקופ פיירצ'יילד וצילום פלאש UV. Coremans et al. הרחיב על המושג הזה באמצעות יחס הקרינה / UV NADH ההחזרה כדי measurה מצב מטבולי של epicardium של Langendorff דם perfused לבבות חולדה 30. Videofluorimeter שימש הדמיה הנתונים נרשם באמצעות וידיאו. מאוחר יותר, שולץ ואחרים. השתמשו במערך הספקטרוגרף ו photodiode למדוד fNADH הממוצע מאזור גדול של LV. גישה זו צמצמה את ההשפעות של הקרינה heterogeneities epicardial ווריאציות מקומיות במחזור תוך חשיפת מאקרוסקופיים הקשורים לעבודה וריאציות של fNADH 31. גישה זו דומה לממוצע מחשוב רמות fNADH עבור אזור עניין בכל המסגרות של בסיס הנתונים fNADH הדמיה, כפי שמודגם באיור 2. כפי שכבר הוצג במאמר זה, הטכנולוגיה של היום מספק מהירות גבוהה מצלמות CCD ונשלט באופן דיגיטלי הספק גבוה זרקורים UV. טכנולוגיות אלה מאפשרות את הדינאמיקה של spatiotemporal fNADH ומטבוליזם לב להיחקר מנקודות מבט חדשות רבות. בעלות נמוכה יחסית של אופטיקה מקור האור עושה FNADH הדמיה אביזר שימושי לב במערכות קונבנציונליות מיפוי אופטי. 9, 32

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ-NIH (R01-HL095828 כדי MW קיי).

Materials

Chemical Company Catalogue Number
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911-500G
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968-500G
NaPyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256-25G
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418-100G
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 .
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  3. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
  4. Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
  5. Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
  6. Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
  7. Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
  8. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
  9. Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
  10. Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
  11. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. , 1-4 (2008).
  12. Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
  13. Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
  14. Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
  15. Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
  16. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  17. Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
  18. Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
  19. Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
  20. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
  21. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
  22. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
  23. Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
  24. Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
  25. Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
  26. Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
  27. Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
  28. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
  29. Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
  30. Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
  31. Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
  32. Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Tags

NADH Fluorescence ImagingIsolated Perfused HeartLangendorff TechniqueCardiac PhysiologyCardiac MetabolismLV Working Heart ModelBiventricular ModelStroke VolumeCardiac OutputPressure DevelopmentMyocardial InjuryIschemiaNADH Fluorescence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image