Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

I. Reaktif Hazırlama Antikor Seçimi ve Hazırlanması Deneyinde kullanılacak olan antikorlar tanımlar. Dört yakalama antikorlar: monoklonal veya poliklonal ya insan TNF-alfa, özel, tüm aynı ana türler. Dört algılama antikorlar: insan biyotinile ya değiştirilmemiş TNF-alfa,,, ya PE-konjuge için özel. Bir teyidi antikoru: PE-konjuge ve antikor çekimi ana türler için spesifik. Üretici tarafından önerilen çalışma yoğunluklarına çözün tüm antikorlar. Düşük Konsantrasyon MagPlex mikroküre (boncuk) setleri veya bölgelerde dört şişe seçin, örneğin, Luminex parça numaraları MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID ve MC10015-ID. XMAP Antikor (AbC) Kaplin kiti kullanılarak, MagPlex Mikroküreler karşı antikorlar Kaplin Rekomple kaplin prosedürü için AbC Seti Kullanım Kılavuzu (Part # 89-00002-00-319) için fer. (Not: Mümkün Fotosensitif mikroküreler ışıktan korunmalıdır.) Eşleme tepkimesi için seçilen boncuk bölgesi numaraları ile oda sıcaklığında ve etiket dört reaksiyon tüplerine AbC kiti içinde reaktiflerin getirir. Dört etiketli reaksiyon tüpleri içine MagPlex boncukların dört şişe (1 mL, her veya 2.5 x 10 6 boncuklar) içeriğini transfer edin. Olarak AbC kiti kılavuzda açıklanan Aktivasyon Tampon, 500 uL iki kez boncuk seti her yıkayın. AbC kiti kılavuzunda prosedüre göre, aktivasyon tamponu, sülfo-NHS 10 uL, ve EDC reaktifin 10 ul 480 ul her bir boncuk grubu etkin ve 20 dakika süreyle inkübe edilir. (Not:. EDC reaktifi bu adımı hemen önce Aktivasyon Buffer 250 uL olarak yeniden olmalıdır) Thr toplam şimdi "aktif" mikrosferler ile önceki yıkama adımıAktivasyon Tampon 500 uL ee kez olarak AbC kiti kılavuzda açıklanan. Dört ayrı çözümler, Aktivasyon tampon yakalama antikor her biri 7.5 mg (yani, 3 g / milyon mikroküreler) hazırlayın. Hemen girdap, kendi reaksiyon tüpleri için her bir tüpü bu dört yakalama antikor çözümleri ekleyin ve bir rotator iki saat inkübe edin. Şimdi AbC kiti ile birlikte Yıkama Tamponu 500 uL üç kez toplam "birleştirilmiş" mikrosferler ile önceki yıkama adımı yineleyin. En son yıkama adımdan sonra, mililitrede 5 milyon antikor-coupled boncuk son bir stok konsantrasyonu sağlamak için her reaksiyon tüpüne 500 uL Yıkama Tamponu ekleyin. Vortex ve mikroküreler dağıtmak için reaksiyon tüpleri ses dalgalarına maruz. NOT: Kısmen DI su ile dolu bir ultrasonik temizleyiciye kapalı mikroküre flakon daldırarak tüm yıkama adımları için etkili sonikasyon sağlar. (E için malzemeler tabloya bakınquipment ayrıntıları.) 2-8 birleştiğinde boncuklar ° C'nin ve ihtiyaç kadar ışıktan korunmalıdır. Coupled Mikroküreler sayımı Hücre sayıcı veya hemasitometre kullanarak birleştirme tepkimesinden sonra kurtarıldı mikroküre sayısını. Bunu yapmak için uygun talimatlar için sayım cihazı kullanım kılavuzuna başvurun. Eşleme tepkimesi ile geri kazanım 90 üzerinde% tipik olarak. Kaplin Onay Bağlama reaksiyonu, onaylamak tayin tamponu içinde 100 boncuklar / ul son konsantrasyon (% 1 BSA ile PBS) ile birlikte, her grubu için akuple boncuk stoklarının test solüsyonları hazırlayarak başarılı olmuştur. Deney tamponu içerisinde 4 ug / mL 'de phycoerythrin-(PE-) etiketli anti-IgG türler teyidi antikoru ile dilüe. 16 kuyu olmak üzere toplam bir yuvarlak tabanlı, 96-plaka dört kuyu, içine her test çözüm kısım 50 uL. Daha sonra 50 μ ekleyinArka plan ve sekiz kalan kuyulara seyreltilmiş onay antikor 50 uL ölçmek için kuyu sekiz içine Assay Tampon L,. Bir çok kanallı pipet ile birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve yavaşça reaksiyonlar karıştırın. Kapak plakası, bir plaka karıştırma cihazı üzerinde, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. Çözeltinin içinde boncuklar çizmek için 1-2 dakika için manyetik bir levha üzerine ayırıcı plaka yerleştirin. Sonra, bir atık, ayırıcı iken, zorla ters plaka ile sıvı çıkarın. Deney tamponu 100 ul ekleyerek ve manyetik plakası ayırıcı kullanılarak benzer bir şekilde plakadan süpernatan kaldırarak iki kez de, her yıkanır. Hafifçe çok kanallı pipet ile beş kez aşağı yukarı pipetleme tarafından Assay Tampon 100 uL içinde boncuklar yeniden süspanse edin. Böyle MAGPIX Enstrüman olarak Luminex xMAP enstrüman, analiz edin. Bu reaksiyon flüoresan sinyalinin yoğunluğu directl olduğuy, boncukların yüzeyinde protein miktarı ile orantılı boncuklar akuple protein miktarının nispi bir hızla değerlendirmesi vermektedir. Algılama için Değiştirilmemiş Antikorlar için Biotin Kaplin Değiştirilmemiş algılama antikorlar kullanıyorsanız, Thermo Fisher EZ-Link sülfo-NHS-LC-Biotin Reaktif (Cat.No. PI-21335) ve prospektüste tanımlanan prosedüre bu antikorlar biotinylate. Onlar xMAP analizörü ile tespit edilebilir, böylece bir kez biyotinile, algılama antikorlar daha sonra tayininde streptavidin fikoeritrin (SA-PE) (Adım III.6.) Ile etiketli olabilir. II. Test Kurulum XMAP Assay sahip en etkili olduğunu belirlemek için% 1 BSA (tayin tamponu. Malzeme tablosu) ile PBS 0.96 mL, her biri 10 uL ilave edilerek tüm dört boncuk seti bir başlangıç ​​karışımı hazırlandı. Dil ile tespit antikor çözümler hazırlayın1 ug / mL, tayin tamponu içinde, her uting. Test Tampon pg / mL 2000 R & D Systems, TNF-α protein standart hazırlayın. 8 ug / mL, tayin tamponu içinde üzere Streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (@ 1 mg / mL sağlanan) ile seyreltilir. III. Antikor Tarama Tarama deneyi için bir Costar yuvarlak tabanlı 96-kuyulu plakanın 16 kuyu her birine antikoru-kupleli mikrosfer karışımı 50 uL ekleyin. Arka plan ölçmek için, 16 kuyu 8 ila deney tamponu 50 uL ekleyin. Yanıtı ölçmek için, diğer 8 kuyu için R & D Systems TNF-α standart (@ 2,000 pg / mL) 50 uL ekleyin. Bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, ışıktan korunan oda sıcaklığında, bir saat boyunca inkübe edilir. Bir test plakası üzerine sha çalkalanırken, dört kuyucuk (iki arka plan ve iki tepkisi) için dört algılama antikorların her biri 50 uL ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübeker. Bütün kuyucuklara SA-PE reaktifin 50 uL ekleyin ve bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, ışıktan korunan, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Bir dakika boyunca manyetik bir levha üzerine ayırıcı plaka yerleştirmek ve sonra zorla ters plakası tarafından sıvıyı. 16 kuyu her birine 100 uL deney tamponu ekleme, bir dakika süreyle plaka manyetik ayırıcı plaka üzerine yerleştirmek ve daha sonra da ayırıcı üzerinde güçlü bir şekilde ters plakası tarafından sıvıyı. 16 kuyuların her Assay Buffer 100 mcL ekleyin ve Luminex MAGPIX alet ile plaka okuma; düzgün çalışması için kullanım kılavuzuna bakarak. İstediğiniz sinyal gücünü karşılayan bir antikor çifti seçin. IV. xMAP Fonksiyonel analizde En yakalama antikoru seçildikten sonra, tayin tamponu ile 10 ml olduğu antikor-kupleli boncuk stokunun 100 uL (Basamak IB8 itibaren) seyreltik. 50 uL eklemeİki Costar yuvarlak tabanlı 96-kuyucuklu plak 78 kuyucuklara seyreltilmiş boncuklar. (78 kuyu x 2 tabak = 156 kuyu) Her plaka farklı bir algılama antikor performansını değerlendirmek için kullanılacaktır. 8000 de başlayan, 12-noktalı bir standart eğri hazırlayın 4 de pg / mL ve bitiş R & D Systems TNF-α standart pg / mL. 78 kuyu / plaka toplam, bir arka plan olarak, deney tamponu, her biri 50 uL altı 50 uL levhalarının her biri için her bir seyreltme çoğaltır, artı altı kuyu ekleyin. Bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, ışıktan korunan oda sıcaklığında, bir saat boyunca inkübe. Birinci plakanın her 78 kuyucuklara ilk tespit antikorun 50 uL ekleyin. İkinci plaka üzerindeki ikinci antikor tespiti için tekrarlayın. Bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalanırken ışıktan korunan oda sıcaklığında, at, 30 dakika süreyle inkübe. Her plaka tüm kuyulara SA-PE reaktif 50 uL ekleyin. ÜretmekBir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, oda sıcaklığında 15 dakika için iki levha, ışıktan korunan. Bir dakika için manyetik ayırıcılar plaka üzerine tabak yerleştirin, daha sonra ise ayırıcı üzerinde zorla ters plaka ile sıvı çıkarın. Plakalar üzerinde 78 kuyuların her Assay Buffer 100 mcL ekleyin; bir dakika için manyetik ayırıcılar plaka üzerine tabak yerleştirin, sonra zorla ters plaka ile sıvı çıkarın. Plakalar üzerinde 78 kuyuların her Assay Buffer 100 mcL ekleyin ve düzgün çalışması için kullanım kılavuzuna bakarak, MAGPIX cihaz üzerinde analiz. V. ELISA Testi R & D Systems İnsan TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kiti (Ar-Ge Bölüm # DY210) birlikte verilen yönergeleri izleyerek, Ar-Ge kitinde standart tarafından oluşturulan yanıtı ölçmek. R & D Systems yakalama ve algılama karınca yerine, ELISA testi üç kez daha tekrarlayındiğer satıcıların antikorlar ile ibodies. Basitlik, çifti satıcı tarafından antikorlar (örn Millipore algılama antikor ile Millipore yakalama antikor, Abcam algılama antikor ile Abcam yakalama antikor, vb) için. Üç TNF-α protein standartları her biriyle gibi ELİSA formatı gereği, birbirinden bağımsız her çifti değerlendirin. VI. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol hızla tahlil optimize etmek için teknolojinin multipleks kapasitesini kullanırken diğer yandan da tipik bir ELISA xMAP platformuna dönüştürülebilir gösterilmiştir. Bu örnekte kullanılan ELISA İnsan TNF-alfa (TNF-α) R & D Systems DuoSet ELISA kiti (Ar-Ge Bölüm # DY210) idi. Kiti içinde sağlanan antikor çifti ek olarak, farklı kaynaklardan (Malzeme tablosu) gelen diğer üç antikoru çiftleri xMAP platformu ile eş zamanlı olarak değerlendirildi. Foantikorların ur yakalama antikor olarak tayin edildi ve MagPlex Düşük Konsantrasyon Mikroküreler akuple edilmiştir. Diğer dört antikorlar tespit antikor olarak tayin edildi; biotin çiftli olarak satın alındı ​​ve Protokol açıklandığı gibi dördüncü biyotinile edildi üçü. Bu çalışma için antikorlar kullanılabilirliği ve satıcıya göre seçilmiştir. Ancak, pratik ortamda, antikorlar bireysel kullanıcının tercihi ve bu antikor ile geçmiş performansına dayalı deneyim seçilmelidir. Bu deneyde, bir antikor çekimi karşı tespit antikor olarak bir antikorun uygunluğunu test yoktur, ancak bu protokol kolaylıkla bu amaç için değiştirilebilir. Luminex xMAP deneyleri TNF-α antikoru kupleli MagPlex mikrosferler dört set birleştirerek, bir karışımı gibi, dört yakalama antikorlar değerlendirmek için bir multipleks olarak uygulandı. Yakalama antikorlar dört her değerlendirildibireysel biyotinile algılama antikorlar, dört yakalama antikorların her biri ile bir algılama antikor etkileşimi eş zamanlı olarak tespit edilebilir olduğu gibi. Paralel olarak gerçekleştirilir gibi dört deneyleri, dört yakalama antikorları ile birlikte dört algılama antikorların etkileşimler belirlenir. Şekil 1, bu tarama deneyleri ile karşılaştırmalı verileri gösterir. Sonuçları R & D Systems DuoSet gelen antikor çifti 6183 Medyan Floresan Yoğunluğu (MFI) birimleri bir sonuçlanan tepki ile en iyi performansı gösterdi. Ayrıca, R & D Systems yakalama antikoru ile bir araya geldiğinde Millipore (R & D antikoru çifti tepkisinin% 86) ve Abcam (% 67) gelen tarama antikorlar, xMAP deneyde, makul bir yanıt sağladığı gözlenmiştir. Abcam, Millipore ve Novus gelen antikorların yakalama xMAP deneyde, bir daha az arzu tepkisi üretilir. Bu dikkat etmek önemlidir, bu purBu çalışmanın poz belirli antikorlar veya satıcılar arasında farklılıklar ancak sadece benzer koşullar altında kullanılan performans gözlenebilir farklılıklar olduğunu göstermek ve xMAP platformu bu farklılıkları değerlendirmek için etkili bir araç sunabilir için vurgulamak için zorunlu değildir. R & D Systems DuoSet protokolü bir ELISA biçiminde dört antikor çiftleri karşılaştırmak için kullanıldı. R & D Systems protokolü bugün yaygın olarak kullanılan tipik ELISA protokolleri yansıtıcı çünkü tüm antikor çiftleri kullanılabilir ve xMAP teknolojisi ile kullanılan protokoller paraleldir edildi. ELISA testi R & D Sistemlerinden antikoru çifti daha iyi sonuçlar (Şekil 2) verdi olduğunu gösterdi. Abcam gelen antikor çifti Millipore ve Novus üretilen mütevazı cevaplar hiçbir yanıt ve antikor çiftleri üretti. Standardı ile antikor reaktivitesi herhangi bir değişiklik değerlendirmek için, tüm dört antibody çifti üç farklı satıcıları (Malzeme tabloya bakınız), üç farklı rekombinant TNF-α protein standartları ile test edildi. Üç satıcılardan rekombinant TNF-α protein standartlarına eşdeğer sonuçlar verdiği Şekil 2 gösterisinde verileri. R & D Systems, TNF-α proteini ELISA (Tablo 1) ve xMAP deneyleri (Tablo 2 ve 3) ile standart eğri üretmek için kullanıldı. ELISA testi R & D Systems antikor çifti ile yapılırken, xMAP testlerinin R & D Systems veya Millipore gelen R & D Systems yakalama antikor ve algılama antikor ya kullanılmaktadır. R & D Systems, TNF-α proteini 8000 ila 4 pg / ml konsantrasyonlarında bir dizi üretmek için seyreltilmiştir. R & D Systems, sadece antikoru çifti olarak Tablo 2'de gösterildiği gibi, bir yanıt> 20.000 MFI ile xMAP deneyde beklenen sonucu üretilen veŞekil 3. Millipore gelen tarama antikoru R & D Systems algılama antikor yerine (Tablo 3), R & D Sistemlerinden algılama antikoru ile elde edilen yanıt yaklaşık% 30 olan tepkisi (6000 MFI) içinde xMAP Assay ile birlikte kullanıldığı zaman, gösterildiği gibi Şekil 3. Tablo 1'de veri 16-1000 pg / mL üreticinin tavsiye TNF-α menzili vardı ELISA, standart eğrisi temsil eder. 1000 OD pg / mL 2 OD birimleri biraz daha fazla olduğunu ve spektrofotometre 3 OD yukarıda ölçmek mümkün olduğundan, bu aralık çok sınırlı idi. Çünkü spektrofotometre ile limit, daha da ELISA deneyine aralığında arttırmak mümkün değildi. Buna ek olarak, Tablo 1 in veri R & D Systems DuoSet ELISA 16 pg / ml 'den daha az konsantrasyonlarda TNF-α saptamaya muktedir değildir göstermektedir. Diğer taraftan, xMAP assay sinyal kuv yeteneğine sahiptirR & D Systems ya Millipore ya gelen algılama antikoru ile birlikte R & D Sistemlerinden yakalama antikoru ile birlikte en az 7.8 pg / mL 'lik bir konsantrasyonda ING TNF-α. (Şekil 4), bir log-log ölçeğinde çizilmiştir zaman her iki yöntemin dinamik aralık ve duyarlılık daha gösterilmiştir. XMAP testlerden ELISA yanıtları ve yanıtlarının eğimi arasında net bir ayrım daha da yüksek ve düşük konsantrasyonlarda hem de ELISA yöntemi ile TNF-α tespiti için daha sınırlayıcı yeteneği gösterir görülebilir. Iki fonksiyonel TNF-α xMAP deneyleri için algılama (LOD) sınırları bir arka plan daha fazla gözlenen tepki seviyesi (MFI), artı üç kat, standart sapma (SD) ile en düşük, TNF-α konsantrasyonu belirleyerek yaklaştırılır edildi. Istatistiksel anlamlılık ulaşmak için, altı xMAP ve ELISA iki yöntem için SD belirlemek için kullanılmıştır çoğaltır. ThesLOD e tahminleri iyimser ve normal çalışma koşullarında sadece iki veya üç kullanılacak çoğaltır anlayışı ile bir "iyi durum" senaryosu, sağlamak amaçlıdır. Tablo 2 de, bu ölçütleri karşılayan, R & D Systems çifti, 3.91 en düşük TNF-α konsantrasyonu kullanıldığında pg / ml arka + 3SD tepkisi daha büyüktür 66 MFI, bir yanıt üretilen, olduğu görülmektedir . Millipore algılama antikoru R & D Systems Yakalama antikoru (Tablo 3) ile birlikte kullanıldığı zaman, algılama limiti az 7,81 pg / ml olmuştur. Bu durumda, en düşük 2 TNF-α konsantrasyonu 17 MFI kabul edilebilir bir yanıt üretilir; düşük TNF-α konsantrasyonunun büyük müdahale artı üç kez standart sapma. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) Benzer şekilde, R & D Systems DuoSet ELISA için algılama sınırının 63 pg / ml ve 31 pg / mL (Tablo 1) olarak tahmin edilmiştir. <p class = "jove_content"> Şekil 1. Dört yakalama antikorların olası her kombinasyon için R & D Systems standart (@ 2,000 pg / mL) (dört farklı mikroküre bölgelere birleştiğinde) ve dört algılama antikorların ortalama floresan yoğunluğu (MFI). büyük görmek için tıklayın rakam . Şekil 2. Dört yakalama ve algılama antikor çifti kombinasyonları için üç farklı rekombinant standartları (@ 1,000 pg / mL) optik yoğunluk (OD). Yakalama ve algılama antikorlar keyfi basitlik için, satıcı tarafından eşleştirilmiş edildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . <tdcolspan > R & D Systems DuoSet pg / mL OD Std Dev +3 SD 1000 2.084 0.035 2.187 500 1.328 0.038 1.441 250 0.787 0.025 0.863 125 0.476 0.026 0.554 63 0.304 0.023 0.374 31.3 0.212 0.025 0.287 15.6 0.167 <td> 0.026 0.244 0 0.118 0.021 0.182 Tablo 1 standart bir eğri olarak kullanmak için R & D Systems DuoSet prospektüste, tarafından belirtilen 2 kat dilüsyon serisinin optik yoğunluk (OD);. 31.3 arasındaki standart sapma (SD) ve algılama tahmin sınırı (LOD) dahil olmak üzere, pg / ml ve 63 pg / ml. R & D Systems Yakalama ve Tespit Antikorlar pg / mL MFI Std Dev +3 SD 8000 20,320 463 </td> 21,707 4000 15,594 223 16,263 2000 11,098 79 11,336 1000 6,985 160 7,465 500 4,149 80 4,390 250 2,233 30.0 2,323 125 1,199 43.8 1,330 63 636 14.0 678 31.3 340 12.9 379 <strong> 15.6 183 5.9 201 7.8 103 2.2 109 3.9 66 2.4 73 0 11 0.8 13.8 Tablo 2, R & D Systems DuoSet ile birlikte antikor çifti kullanılarak xMAP teknolojisi ile ölçülen bir standart dilüsyon serisinin ortalama floresan yoğunluğu (MFI);. Standart sapma (SD) ve algılama tahmini sınırı (LOD), az 3.91 dahil pg / ml. Millipore Algılama Ab R & D Systems Yakalama Ab pg / mL MFI <strong> Std Dev +3 SD 8000 5,800 143 6,229 4000 3,881 120 4,242 2000 2,176 73 2,396 1000 1,138 32.1 1,234 500 578 31.3 671 250 289 6.2 307 125 142 3.1 151 63 75 5.3 91 31.3 44 3.3 54 15.6 28 2.6 35.5 7.8 17 1.5 21.2 3.9 10 2.0 16.3 0 7 1.4 11.4 Tablo 3 R & D Systems yakalama antikor ve EMD Millipore algılama antikor kullanarak xMAP teknolojisi ile ölçülen bir standart dilüsyon serisinin ortalama floresan yoğunluğu (MFI);. Standart sapma (SD) ve algılama tahmini sınırı (LOD) dahil olmak üzere, daha az 7.81 'den pg / ml. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4084/4084fig3.jpg"/> Şekil 3. Iki xMAP testleri ve R & D Systems DuoSet ELISA standart eğrileri. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 4. XMAP standart eğrileri ve log-log ölçeğinde ELISA standart eğrinin karşılaştırılması. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .