مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة
Summary
ونحن نقدم بسيطة، وشبه كمي للتحقيق في طريقة تشكيل بيوفيلم<em> في المختبر</em>. هذا الأسلوب يستفيد من stemi زايس 2000-C تشريح مجهر (مرفق مع الكاميرا) لمراقبة كلا من توقيت ونمط تشكيل بيوفيلم، وفقا لتقييم وضع المستعمرات التجاعيد.
Abstract
الأغشية الحيوية، أو سطح المرفقة المجتمعات من خلايا مغلفة في المصفوفة خارج الخلية، وتمثل نمط حياة مشتركة لالعديد من أنواع البكتيريا. في غضون بيوفيلم، الخلايا البكتيرية في كثير من الأحيان معرض للتغيير علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك تعزيز المقاومة للمضادات الحيوية وغيرها من الضغوط البيئية 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأغشية الحيوية تلعب دورا هاما في استضافة ميكروب التفاعلات. الأغشية الحيوية تتطور عندما البكتيريا الانتقال من الفردية، وخلايا العوالق لتشكيل معقدة، متعددة الخلايا المجتمعات 2. في المختبر، يتم دراسة الأغشية الحيوية من خلال تقييم تطور الظواهر بيوفيلم محددة. النمط الظاهري بيوفيلم مشترك ينطوي على تشكيل مستعمرات البكتيريا التجاعيد أو مغضن على أجار صلب وسائل الإعلام 3. التجاعيد تشكيل مستعمرة يوفر وسيلة بسيطة للغاية ومفيدة لتحديد وتوصيف سلالات بكتيرية واظهار الظواهر بيوفيلم تتغير، والتحقيق في الظروف البيئية التي تؤثر على تشكيل بيوفيلم. WRInkled تشكيل مستعمرة تخدم كمؤشر على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا إيجابية الجرام على حد سواء، مثل العصوية الرقيقة 4، والبكتيريا سالبة الجرام، مثل الكوليرا الضمة 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، الزائفة الزنجارية 7، و الضمة fischeri 8.
هذه البكتيريا البحرية V. لقد أصبح fischeri نموذجا لتشكيل بيوفيلم نظرا للدور الحاسم من خلال الأغشية الحيوية الاستعمار المضيف: الأغشية الحيوية التي تنتجها V. fischeri تعزيز استعمارها من هاواي قصير الذيل 8-10 الحبار scolopes Euprymna. الأهم من ذلك، لاحظ الظواهر بيوفيلم في المختبر ترتبط قدرة V. خلايا fischeri لاستعمار على نحو فعال الحيوانات المضيف: سلالات ضعاف لتشكيل بيوفيلم في المختبر تملك عيب الاستعمار 9،11، في حين زادت الضغوط العارضةوتتعزز الظواهر بيوفيلم عن الاستعمار 8،12. V. fischeri بالتالي يوفر النظام نموذج بسيط لتقييم الآليات التي تنظم تشكيل بيوفيلم البكتيريا وكيف الأغشية الحيوية تأثير الاستعمار المضيف.
في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri كنظام نموذج. هذا الأسلوب ينطوي على الحذر اكتشاف الثقافات البكتيرية بتركيزات محددة وحدات التخزين على وسائط أجار الصلبة؛ ثقافة المرقطة هو مرادف لمستعمرة بكتيرية واحدة. ويمكن استخدام هذه التقنية "ثقافة رصدت" للمقارنة بين الظواهر بيوفيلم الإجمالي في، واحد نقاط محددة من الوقت (نقطة النهاية المقايسات)، أو لتحديد وتوصيف الظواهر بيوفيلم خفية من خلال الوقت طبعا المقايسات للتنمية بيوفيلم وقياسات القطر مستعمرة ، ويتأثر التي كتبها تشكيل بيوفيلم. وبالتالي، هذا الأسلوب يوفر تحليل شبه كمي لتشكيل بيوفيلم، فيmitting تقييم للتوقيت والزخرفة للتنمية مستعمرة التجاعيد والحجم النسبي للبنية النامية، والخصائص التي تمتد إلى ما بعد التشكل مجمل بسيط.
Protocol
Discussion
في هذا العمل، ونحن وصفا لطريقة شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri بوصفه الكائن نموذج. على وجه التحديد، ونحن الاستفادة من مجهر تشريح مع المرفقات كاميرا لمراقبة تشكيل بيوفيلم والتنمية وتشكيل مستعمرة التجاعيد مع مرور الوقت على سطح صلب أجار. في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة 2 أنواع محددة من الطرق التي نستخدمها عادة لتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. الأول هو فحص نقطة النهاية، والذي يتيح لنا مراقبة، شامل نهائي الهندسة المعمارية 3D، والزخرفة، وقطر لثقافة رصدت في "النهائي" المحدد نقطة مرة. هذا النهج هو أكثر فائدة لتقييم سلالات متحولة أو الظروف التي تؤدي إلى تشوهات كبيرة في تشكيل بيوفيلم. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يميز بين الاختلافات أكثر دهاء وقعت في نقطة زمنية قبل نقطة النهاية المحددة. على نحو أوثق مراقبة التجاعيد تشكيل مستعمرة، نستخدم فحص مسار الزمن، والتي تتيح لنا التعرف بداية ثrinkled تشكيل مستعمرة ومراقبة تطورها على مر الزمن. نتيجة لهذا النهج، يمكن تحديد الاختلافات أكثر دهاء في توقيت تشكيل مستعمرة التجاعيد، والهندسة المعمارية 3D، والزخرفة. استخدمنا هذا الفحص بالطبع وقت لتوليد المؤسستين شبه كمي المقايسات من تشكيل بيوفيلم. أولا، يمكن مقارنة الوقت الذي سلالة يبدأ في تطوير الهندسة المعمارية 3D إلى أن سلالات السيطرة. لقد وجدنا أن التأخير في تشكيل بيوفيلم من متحولة خاصة في ظل نفس الظروف ويتسق إلى حد ما 9. على سبيل المثال، في البيانات التي تظهر في الشكل. 2، ومتحولة برهنوا دائما عن تأخير ح 4 في الشروع في تشكيل بيوفيلم. ثانيا شبه كمي قدر من تشكيل بيوفيلم هو التغير في حجم القطر من مستعمرة التجاعيد (سبوت). لقد وجدنا أن قطر المستعمرات التجاعيد تختلف تدريجيا من أن من غير بيوفيلم المستعمرات، ليبلغ نحو فرقا 2-أضعاف في نهاية الوقت نقطة (الشكل 3 </قوي>) (موريس وVisick، بيانات غير منشورة). حتى الآن، ونحن لم احظ أحد النمط الظاهري دون الآخر (أي تشكيل بيوفيلم دون زيادة في القطر مستعمرة) (بيانات غير منشورة)، على الرغم من أنه لا يزال ممكنا بعض المسوخ وسوف تتصرف بشكل مختلف. في الواقع، فقد أفيد عن V. الكوليرا أن بعض التجاعيد في المستعمرات نتيجة زيادة كبيرة في القطر مستعمرة في حين أن البعض الآخر لا 15. ومع ذلك، يمكن تقييم التغيير في قطر مع مرور الوقت مساعدة في توصيف المسوخ بيوفيلم المحتملة و / أو توفير تدبير إضافي الكمية من المسوخ مع التأخير في عملية التنمية. من التدابير اثنين من تشكيل بيوفيلم (الوقت وقطر)، وتحديد بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد أكثر حساسية، ولكن أيضا أكثر ذاتية، من تحديد القطر من بقعة. وحتى مع ذلك، على حد سواء التدابير تقديم تقييم نصف الكمية من النمط الظاهري يمكن أن يكون مفيدا للغاية للباحثين بيوفيلم لكن غير قابلة بسهولة إلى quantificatioن.
عند إجراء فحوصات مثقف رصدت، من المهم للنظر في الظروف البيئية التي يتم استزراع سلالات رصدت. ويتأثر في كثير من الأحيان التجاعيد تشكيل مستعمرة من قبل الظروف البيئية المختلفة، بما في ذلك توفر المواد الغذائية، ودرجة الحرارة والرطوبة. للحد من التباين بين التجارب، فإنه من المفيد لتوحيد هذه الظروف قدر المستطاع (أي توحيد لوحات أجار إلى وحدة تخزين مجموعة وزراعة سلالات رصدت في درجة الحرارة التي تسيطر عليها). لمزيد من السيطرة على التباين بين التجارب اكتشاف، من المهم أن تشمل سلالات المراقبة المناسبة داخل كل مجموعة من التجارب. أخيرا، عند تفسير البيانات من هذه المقايسات، فمن الضروري إجراء أية تجربة 1 عدة مرات (3 +)، وخصوصا عندما تقييم الفروق الدقيقة في تشكيل مستعمرة التجاعيد (على سبيل المثال، في تأخير تشكيل بيوفيلم أو الاختلافات الزخرفة). بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي: 1) determinقد جي ما إذا كانت الخلايا لديها خلل في النمو يكون من الصعب: نمو الخلايا في ثقافة السائل قد لا تعكس بدقة معدلات النمو في وسائل الاعلام الصلبة، وتحديد دقيق لنمو الخلايا المكونة للبيوفيلم، والتي قد تلتصق ببعضها البعض، قد لا يكون ممكنا؛ 2) سوف سلالات مع عيوب نمو أن يكون مشكلة لتحليل، 3) أنه قد لا يكون من الممكن التمييز بين الاختلافات بين سلالات قطر مع الظواهر بيوفيلم خفية، 4) عن السلالات التي لا تنمو في حلقة مركزية من أنه قد لا يكون من الممكن قياس بدقة تغييرات في قطر، 5) في حين يمكن ملاحظة الزخرفة خلال تشكيل بيوفيلم، لا توجد وسيلة لقياس الزخرفة للبيوفيلم الناتجة عن ذلك؛ و 6) لا توجد وسيلة لقياس Z-البعد عن بيوفيلم مع هذه التجربة انشاء . على الرغم من هذه القيود، يتيح هذا البروتوكول مع ذلك وسيلة للحصول على البيانات الرقمية للمساعدة في تقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة.
في هذا البروتوكول، ونحن الاستفادة من التصوير محددنظام (أي مجهر زايس تشريح وبروخرس CapturePro برامج التصوير) لمراقبة وتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. نظام التصوير وصفها هنا هي قوية: القدرة على الكشف عن بدء تشكيل مستعمرة التجاعيد، وبالتالي تقييم تطور مع الوقت نهج بطبيعة الحال، تتعزز بشكل كبير من خلال استخدام مجهر تشريح. ومع ذلك، إذا كانت هذه التكنولوجيا غير متوفرة، ويمكن تكييفها لبروتوكول للاستخدام مع غيرها من المعدات، بما في ذلك كاميرا رقمية بسيطة، مع التركيز التكبير. في حين أن هذا البروتوكول يركز على تقييم تنمية مستعمرة التجاعيد، يمكن أيضا أن يكون تعديل لتقييم تكوين غشاء رقيق، وهو شكل من بيوفيلم أن يتطور عندما الخلايا تنمو بشكل ثابت في ثقافة السائل. قد يكون هذا البروتوكول يثبت أيضا مفيدة في تقييم المؤشرات الأخرى من تشكيل بيوفيلم، بما في ذلك إدراج الأصباغ محددة في المستعمرات رصدت خلال تطوير بيوفيلم. وتشمل هذه، ولكنها لا تقتصر على والأصباغ مثل الأحمر والكونغو calcofluأو التي يمكن أن تربط إلى السليلوز، وهو عنصر مشترك من الأغشية الحيوية البكتيرية 16. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول، على الرغم من أن وضعت للاستخدام مع خامسا على سبيل المثال لا fischeri، لهذا الكائن الحي ولكن يمكن تعميمها على دراسة تشكيل بيوفيلم في الكائنات عديدة مختلفة، مثل العصوية الرقيقة 4، الضمة الكوليرية 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، والزائفة الزنجارية 7، والتي تشكل كل معرض مستعمرة التجاعيد. وأخيرا، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة morphologies مستعمرة الأخرى التي لها نمط النمو، مثل، ربما، والزخرفة التي تحدث أثناء نمو زانثس Myxococcus 17 و جوي تطوير هيكل في الزائفة الزنجارية 18. هذا البروتوكول هو بالتالي من استخدام العام للباحثين علم الأحياء المجهرية وبيوفيلم.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل NHI R01 منحة GM59690 منحت لKLV.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
| CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
| Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |
Riferimenti
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20 (2005).
- Branda, S. S. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).
- Beyhan, S. Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR. J. Bacteriol. 189, 388 (2007).
- Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus. Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).
- Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function. J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).
- Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).
- Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).
- Nyholm, S. V. Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).
- Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and σ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).
- Mandel, M. J. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215 (2009).
- Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri. J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).
- Geszvain, K., Visick, K. L. The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri. J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).
- Krasteva, P. V. Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP. Science. 327, 866 (2010).
- Romling, U. Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae. Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).
- Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).
- Lee, K., Veeranagouda, Y. Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures. Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).
