Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. Essi costituiscono una parte essenziale del sistema immune innato ^1. Durante l'infiammazione acuta, i neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a migrare verso il luogo della ferita. Assunzione di neutrofili a un sito della lesione è un processo graduale che comprende in primo luogo, la dilatazione dei vasi sanguigni per aumentare il flusso di sangue, in secondo luogo, microvascolari cambiamenti strutturali e la fuga di proteine ​​del plasma dal sangue, in terzo luogo, rolling, adesione e la trasmigrazione dei neutrofili attraverso l' accumulo di neutrofili e quarto al sito della lesione ^2,3; endotelio. Una vasta gamma di in vivo e in vitro è evoluto per consentire lo studio di questi processi ^4. Questo metodo si concentra sulla trasmigrazione neutrofili attraverso cellule endoteliali umane.

Un metodo popolare per esaminare i processi molecolari coinvolti nella trasmigrazione dei neutrofili utilizza umana neutrophils interagiscono con le cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC) ^5. L'isolamento dei neutrofili è stato descritto visivamente altrove ^6; così questo articolo mostrerà il metodo per l'isolamento di HUVEC. Una volta isolate e coltivate a confluenza, le cellule endoteliali vengono attivate causando la sovraregolazione di molecole di adesione e di attivazione. Ad esempio, l'attivazione di cellule endoteliali con citochine come TNF-a risultati aumentati E-selectina e IL-8 espressione ^7. E-selectina media di cattura e di rotolamento dei neutrofili e IL-8 di attivazione media e ferma adesione dei neutrofili. Dopo l'adesione dei neutrofili trasmigrare. Trasmigrazione può avvenire paracellularly (mediante giunzioni di cellule endoteliali) o transcellularly (attraverso la cellula endoteliale stesso). Nella maggior parte dei casi, queste interazioni avvengono in condizioni di flusso presenti nel sistema vascolare ^7,8.

Il parallelo camera di flusso piatto è un sistema largamente utilizzato, che mimicrofoni il taglio idrodinamico sollecitazioni trovato in vivo e permette lo studio del reclutamento dei neutrofili in condizioni di flusso in vitro ^9,10. Diverse aziende producono parallele camere di flusso di targa e hanno ciascuno vantaggi e svantaggi. Se fluorescente immagini è necessario, vetro o un polimero otticamente simile deve essere utilizzato. Le cellule endoteliali non crescono bene su vetro.

Presentiamo qui un metodo semplice e rapido per l'imaging a contrasto di fase, DIC e fluorescente di trasmigrazione neutrofili con un basso volume di diapositiva canale ibidi fatto di un polimero che supporta l'adesione e rapida crescita di cellule endoteliali e ha qualità ottiche comparabili a vetro. In questo metodo, le cellule endoteliali sono state coltivate e stimolata in μslide ibidi. I neutrofili sono stati introdotti in condizioni di flusso e la trasmigrazione è stata valutata. Imaging a fluorescenza delle giunzioni attivato in tempo reale la determinazione del grado di paracellulare rispettotrasmigrazione transcellulare.