流感病毒从感染细胞的染色质的核糖核蛋白复合物的亲和纯化
Summary
流感病毒与宿主细胞染色体复制他们在协会的RNA基因组。在这里，我们提出了一个方法来净化完整的病毒核蛋白复合物，从感染细胞的染色质。纯化病毒复合物，可以分析，Western blot和引物蛋白质和RNA含量的扩展，分别。
Abstract
像所有的负链RNA病毒，流感病毒的基因组在病毒核蛋白复合物（vRNP），单链的基因组，其中encapsidated由核蛋白（NP），三聚聚合酶组成的复杂关联的形式打包的PA，PB1和PB2亚基。然而，在大多数RNA病毒，流感病毒感染细胞的细胞核中执行病毒RNA的合成。有趣的是，病毒mRNA的合成采用细胞mRNA前，为引物，并已提出，这个过程需要1对染色体的地方。也被病毒聚合酶和RNA聚合酶II的主机，以及NP和主机的核小体之间的相互作用特点1,2。
近日，代编码单链球菌标签的重组流感病毒的基因融合病毒聚合酶PB2亚基C-末端（rWSN铅，链球菌3）已成为EN描述。这些重组病毒PB2-含复合物，包括vRNPs从被感染的细胞，使净化。为了获得纯化vRNPs，被感染的细胞培养，vRNPs有亲和力，从来自这些细胞裂解纯化。然而，迄今用于裂解程序已根据上一步的洗涤剂溶解，尽管一般核酸的存在，往往只提取染色质结合材料低效。
我们的前期工作的建议，没有在传统的细胞裂解提取大量的核vRNPs的部分，因此，不能亲和纯化。为了提高提取效率，并从非绑定到染色质的核vRNPs分开染色绑定，我们适应了一步明智的亚流感病毒感染的细胞提取协议。简言之，此过程首先从细胞核分开，然后提取可溶性核蛋白（这里称为“核质”的部分）。其余的不溶性的核材料，然后消化Benzonase，非特异性的DNA / RNA核酸，其次是两个盐提取步骤：首先使用150 mM氯化钠（称为“ch150”），然后500毫米的NaCl（“ch500”（ 图1） ）。根据我们的观察，这些盐的提取步骤被选为500 mM氯化钠充分溶解超过核vRNPs 85％，但仍允许亲和力矩阵标签vRNPs具有约束力。
受感染的细胞的亚细胞分离后，它是可能亲和力净化PB2标签从每个人的分数vRNPs和分析其蛋白质和RNA的组成部分，分别用Western blot和引物延伸，。最近，我们利用这种方法，发现在感染后的后期染色质部分提取500 mM氯化钠（ch500）3点，vRNP出口复合物的形式。
Protocol
Discussion
虽然最近已经有很多研究发现流感病毒感染的8所涉及的个别蛋白质或蜂窝网络，大多数这些相互作用的功能意义尚不清楚。鉴于流感病毒RNA的合成和复杂的生物物理和生物化学性质的核9基于染色质功能的绝对依赖，新技术将被要求澄清这些功能。我们在座的亚核分馏，加上亲和纯化的vRNPs，允许表征至关重要病毒RNA工厂这是以前无法进入的。
许多亚细胞分馏…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢为rWSN PB2-链球菌病毒纳达Naffakh和玛丽 – 安妮Rameix Welti（巴斯德研究所）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Riferimenti
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