تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة
Summary
فيروسات الأنفلونزا من تكرار الحمض النووي الريبي الجينوم بالاشتراك مع الخلية المضيفة لونين. هنا، نقدم طريقة لتنقية سليمة المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية من لونين من الخلايا المصابة. يمكن تنقية المجمعات فيروسي يتم تحليلها من قبل كل من لطخة غربية والإرشاد التمهيدي من البروتين ومحتوى الحمض النووي الريبي، على التوالي.
Abstract
على غرار جميع فيروسات RNA سلبي حبلا، يتم حزم الجينوم من فيروسات الانفلونزا في شكل مجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNP)، التي يتم فيها encapsidated الجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل من البروتين النووي (NP)، ويترافق مع مجمع بوليميريز مثلوثي تتكون للسلطة الفلسطينية، PB1، ومفارز PB2. لكن، على النقيض من معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي، فيروسات الانفلونزا الفيروسية أداء توليف الحمض النووي الريبي في نوى الخلايا المصابة. ومن المثير للاهتمام، الفيروسية تخليق مرنا يستخدم الخليوي قبل mRNAs كما الاشعال، واقترحت أن تتم هذه العملية في لونين 1. التفاعلات بين البلمرة الفيروسية وبوليميريز الحمض النووي الريبي الثاني المضيفة، وكذلك بين الحزب الوطني و nucleosomes المضيفة كما تميزت 1،2.
في الآونة الأخيرة، وتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف ترميز واحدة تنصهر فيها بكتيريا طلال أبو غزاله وراثيا لمحطة-C من الوحيدات PB2 من بوليميريز الفيروسي (rWSN-PB2 بكتيريا-3) قد يكونووصف EN. هذه الفيروسات المؤتلف السماح للتنقية من PB2 المحتوية على المجمعات، بما في ذلك vRNPs، من الخلايا المصابة. للحصول على تنقية vRNPs، يصاب الثقافات الخلية، وvRNPs هي تقارب تنقيته من lysates المستمدة من هذه الخلايا. ومع ذلك، وقد وضعت إجراءات تحلل تستخدم حتى الآن على خطوة واحدة تحلل المنظفات، والذي، على الرغم من وجود nuclease العامة، واستخراج كثير من الأحيان لونين متجهة الى مادة غير فعال فقط.
عملنا الاولية اشارت الى ان عدم استخراج جزء كبير من vRNPs النووية خلال تحلل الخلية التقليدية، وبالتالي لا يمكن أن يكون تقارب المنقى. لزيادة كفاءة هذا الاستخراج، وفصل الكروماتين ملزمة من غير لونين متجهة vRNPs النووية، وتكييفها لدينا خطوة حكيمة بروتوكول الاستخراج التحت خلوية إلى الخلايا المصابة بالفيروسات الأنفلونزا. باختصار، هذا الإجراء يفصل لأول مرة من نواة الخلية ومن ثم استخراج البروتينات النووية القابلة للذوبان (وهو ما يسمى هنا "النواة للهيولى" جزء).يتم هضمها ثم ما تبقى من المواد النووية غير قابلة للذوبان مع Benzonase، وهي غير محددة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي nuclease، تليها خطوتين استخراج الملح: الأولى باستخدام 150 مم كلوريد الصوديوم (وهو ما يسمى "ch150")، ثم كلوريد الصوديوم 500 ملم ("ch500") (الشكل 1 ). وقد تم اختيار هذه الخطوات استخراج الملح على أساس ما نلاحظه 500 ملم كلوريد الصوديوم كان كافيا لذوبان أكثر من 85٪ من vRNPs النووية حتى الآن لا تزال تسمح ملزم من vRNPs المفتاحية للمصفوفة تقارب.
بعد تجزئة التحت خلوية من الخلايا المصابة، فمن الممكن أن تنقي vRNPs تقارب PB2 الموسومة من كل جزء فردي وتحليل البروتين ومكوناتها باستخدام الحمض النووي الريبي البقعة الغربية وتمديد التمهيدي، على التوالي. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه الطريقة لأننا نكتشف أن vRNP شكل مجمعات التصدير خلال نقاط في وقت متأخر من بعد الإصابة على جزء لونين المستخرجة مع كلوريد الصوديوم 500 ملم (ch500) 3.
Protocol
Discussion
في حين أن العديد من الدراسات قد حددت مؤخرا البروتينات الفردية أو الشبكات الخلوية العاملة في عدوى فيروس الانفلونزا 8، وأهمية وظيفية لغالبية هذه التفاعلات لا يزال غير واضح. بالنظر إلى الاعتماد المطلق من لونين على أساس وظائف لتخليق فيروس انفلونزا الحمض النووي ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ندى Naffakh وماري آن Rameix-يلتي (معهد باستور) لفيروس rWSN-PB2-بكتيريا.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Riferimenti
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA–proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
