Die Induktion von Adhäsions-abhängigen Signale mit geringer Intensität Ultraschall

1. Beschichtung von Oberflächen mit Matrix-Ligand Ultraschall wird, um Zellen in 3,5-cm Brunnen angelegt werden, entweder als einzelne Gerichte oder als 6-Well-Platte. Für biochemische Assays, Ligand Mantel direkt auf dem Kunststoff. Für Immunfluoreszenz, Deckgläser aufkochen Glas dreimal in MilliQ Wasser und Platz 4 Deckgläser in den Boden jeder Vertiefung. Glasflächen müssen derivatisiert werden, um eine effiziente Liganden Beschichtung zu gewährleisten. Man löst Sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide Ester in PBS mit 1 mM. 2 ml in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen der derivatisierten Oberflächen 3-mal mit PBS. Coat derivatisiert entweder Glas oder Kunststoff mit unbehandelten Integrin-Liganden. Auftragen von 2 ml 10 ug / ml Integrin ligand9, in PBS mit Ca 2 + und Mg 2 + gelöst, so dass jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht Planen monopartikuläre BSA durch Erwärmen von 1% BSA in PBS gelöst, auf 85 ° C für 13 Minuten. Erlaubenabkühlen lassen und dann durch ein 0,45-um-Filter. Waschen Liganden-beschichteten Oberflächen 3 mal mit PBS und mit dem Block monopartikulären BSA für 30 Minuten. 2. Herstellung von Zellen Um die Umgebung der Matrix während des Experiments zu steuern, sollte die Proteinsynthese durch Zugabe von 25 ug / ml Cycloheximid zu 80% konfluent Fibroblasten für 2 Stunden blockiert. Spülen Cycloheximid-behandelten Zellen mit PBS und lösen sich vom Kulturgefäß unter Verwendung von 0,5 mg / ml Trypsin / EDTA. Ernte abgelösten Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 Minuten. Die Zellen in DMEM/25 mM HEPES, 25 ug / ml Cycloheximid. Anzahl Zelldichte der Suspension unter Verwendung eines Hämozytometers und mit Wasser auf 105 ml-1. Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 20 Minuten an die Oberfläche Integrin erholen. Spülen Sie die Liganden-beschichteten, BSA-blockierten Vertiefungen 3mal mit PBS. Seed 2 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung. Allow Zellen für 2 Stunden bei 37 ° C verteilt, 5% CO 2. 3. Ultraschall-Stimulation Warm die Ultraschall-Emitter-Array und Kopplungsgel auf 37 ° C Tragen Sie eine erbsengroße Klecks Kopplungsgel zu jedem Emitter. Testen Sie, dass jeder Sender ist funktional mit einem Ultraschall-Indikator Diodendetektor. Legen Sie die Vertiefungen auf der Emitter-Array. Zurück Arrays auf 37 ° C, 5% CO 2 und damit sich das Wasser für 10 min lang sich ausgleichen. Schalten Sie den Ultraschall-Signal. Das Ultraschallsignal wird nach 20 Minuten deaktivieren, imitiert das therapeutische Regime. Wenn kürzere Zeiten Stimulation erforderlich sind, sollten Platten aus dem Array zu gegebener Zeit-Punkte entfernt werden. In allen Fällen verwenden Platten als negative Kontrolle unstimulierten. 4. Focal Adhesion Analyse durch Immunfluoreszenz Für die Analyse von fokalen Adhäsionen, gelten die 20-minütige Ultraschallsignalund dann die Entstehung von Strukturen, um für weitere 40 Minuten durch die Aufrechterhaltung Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 zu entwickeln. Saugen Medien und zu fixieren Zellen durch Anwendung von 2 ml 4% Paraformaldehyd in PBS. Inkubieren für 14 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Paraformaldehyd und spülen dreimal mit PBS, die Anwendung des PBS sanft den Rand des Brunnens, die Erzeugung von Scherkräften zu vermeiden. Übertragen jedes Deckglas von den 3,5 cm und einer 24-Well-Platte für die nachfolgende Immunfluoreszenzfärbung. Quench restliche Paraformaldehyd durch Aufbringen von 0,5 ml 0,1 M Glycin in PBS in jede der 24 Vertiefungen. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Glycin absaugen und spülen Sie drei Mal mit PBS. Permeabilisieren Zellen durch Aufbringen von 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Inkubieren für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Triton X-100 und spülen Sie drei Mal mit PBS. Sperren, indem 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Inkubieren über Nacht bei 4 & dz. B., C. Stain Vinculin-haltige fokalen Adhäsionen mit hVIN-1-Antikörper verdünnt 1:400 in BSA-Block. Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur. Spülen Sie dreimal mit PBS. Anwenden Fluorophor (DyLight 488)-konjugierten sekundären Antikörper (1:200 verdünnt) und Fleck Aktin mit TRITC-Phalloidin (1:200 verdünnt) in BSA-Block. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen dreimal mit PBS und einmal mit Wasser. Montieren auf einem Glasträger in einer umgekehrten Position mit Gold-Deckfluessigkeit verlängern. 5. Die Quantifizierung der Rac1-Aktivierung durch Pull-down-Assay Für die Analyse von Rac1 Aktivierung gelten die 20-minütige Ultraschallsignal an Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2. Bei der Beurteilung Reaktionszeiten länger als 20 Minuten, gelten die Ultraschallsignal für 20 Minuten und zu halten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für die verbleibende Zeit, damit die Reaktion zu entwickeln. Aspirieren Medien und Ort guts auf dem Eis. Spülen Sie die Taschen mit 2 ml kaltem PBS und saugen. Stellen Sie sicher, restliches PBS wird durch Verlassen Brunnen für 1 Minute durch sorgfältige Aspiration gefolgt gekippt entfernt. Lyse-Zellen auf Eis mit 35 ul Lysepuffer (10% Glycerin, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × gesamte Protease-Inhibitor) pro Vertiefung. In diesem Beispiel sind 6 Vertiefungen pro Zeitpunkt verwendet zu 210 ul Zelllysat zu erzeugen. Mehr oder weniger Quellen können verwendet werden, aber insgesamt Lysat Volumen sollte insgesamt ~ 200 pl. Scrape Zellen gründlich mit Zellenabstreifer um vollständige Lyse der Zellen zu gewährleisten und zu verlassen Vertiefungen geneigt für 1 Minute, bis Lysat zu bündeln. Das Lysat zu einer eiskalten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Pooling Lysaten aus gleichen Behandlungsregime) und drehen sich mit 21.000 × g für 2 Minuten bei 4 ° C bis Pellet Zelltrümmer. Übertragen Sie 180 ul Lysat zu eiskalter 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 130 ul Lysepuffer und 25 ul PAK-glutathione Agarosekügelchen 10. Halten verbleibenden Rohlysat bei -20 ° C für die anschließende Gel-Trennung. Erfassen aktiven Rac1 auf die PAK-Glutathion-Agarose-Kügelchen durch Drehen Röhrchen für 40 Minuten bei 4 ° C Ernte Agarosekugel Konjugate durch Zentrifugation bei 2000 × g für 1 Minute bei 4 ° C Wash Wulst Konjugate dreimal mit 500 ul Lysepuffer, Ernte Kügelchen durch Zentrifugieren bei 2000 x g und Verwerfen Überstand nach jedem Waschen. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Lyse Waschpuffer mit einer 200 ul Pipette. Eluieren jede Probe durch Zugabe von 35 ul SDS-PAGE-Ladepuffer und inkubieren bei 85 ° C auf einem Schüttler Heizblock für 5 Minuten. Entfernen Kügelchen durch Zentrifugieren bei 21.000 × g für 1 Minute. Auflösen Wulst Eluat durch SDS-PAGE, auf Nitrozellulose und Sonde für Rac1 übertragen. 6. Repräsentative Ergebnisse In diesem Protokoll beschreiben wir die Induktion von Vinculin-Flecked fokalen Adhäsionen und Rac1-Aktivität durch Ultraschall. Für die focal adhesion Experiment ist die Ausgangssituation, dass Fibroblasten auf einem Liganden von α 5 β 1-Integrin zu verbreiten bilden keine Vinculin-haltige Verwachsungen (Abb. 3A), es sei denn eine zweite Fibronectinrezeptor, Syndecan-4, wird durch Zugabe von engagiert löslichen Liganden (3B) 3,4. Allerdings induziert Stimulation mit Ultraschall Mittelpunkt Adhäsionsbildung im gleichen Umfang wie der Eingriff Syndecan-4 (3C), was anzeigt, dass Ultraschall-Stimulation kann für bestimmte Komponenten des Fibronectin-abhängigen Signalweg 5 ersetzen. Der Schlüssel Hürde mit diesem Protokoll wird die Beseitigung fokalen Adhäsionen in der Abwesenheit von Stimulanzien. Unvollständige Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid ermöglicht Matrixablagerung, die ausreicht, damit die Zellen automatisch zu stimulieren. Die Überbelegung der Zellen kann auch auf Low-Level-focal adhesion formatio führenn und ein schlechtes Ansprechen auf Ultraschall als Übersprechen zwischen Zell-Zell-und Zell-Matrix Kontakte werden erschwert ein Experiment, das entworfen, um einen einzigen Reiz isolieren wird. Als Entwicklungspartner der Grund-Test zeigen wir das gleiche Experiment, mit Fibroblasten fehlen Syndecan-4 (Abb. 4) wiederholt. Diese Fibroblasten noch Ultraschall (4C) zu reagieren, aber nicht an Syndecan-4-Liganden (4B) zu reagieren. Das Experiment mit SDC4 – / – Fibroblasten zeigt, dass Ultraschall kann in der Tat umgehen die Notwendigkeit bestimmter Fibronectin-Rezeptoren, und zeigt, wie die einfache Protokoll entwickelt werden, um zusätzliche Informationen über den Signalweg zu gewinnen. Für die biochemische Experiment zeigen, dass Ultraschall Aktivierung von Rac1 zu induzieren, unter Verwendung eines Pull-Down-Assay, der eine Anpassung des Verfahrens von Del Pozo et al. 10 beschrieben ist. Niederschlag der aktiven Rac1 0, 10, 30 und 60 Minuten nach der inirenzierung von Ultraschall Stimulation zeigt, dass Rac1-Aktivität Peaks bei 10-30 Minuten, vor der Rückkehr zur Basislinie (Abb. 5). Blot Rohlysaten für Vinculin sorgt äquivalente Belastung zwischen den Zeitpunkten. Das Ergebnis ähnelt Aktivierung von Rac1 durch den Eingriff des Syndecan-4 3, ist aber etwas langwieriger sein als die Aktivierung durch Fibronektin. Deshalb 8-10 Wiederholungen werden in der Regel erforderlich, um aussagekräftige Daten zu erzielen. Die Aktivierung von Rac1 ist verantwortlich für die Verpflichtung von Zellen zu fokalen Adhäsionen, und im Entstehen begriffenen Fokaladhäsionen beginnen bei 10-30 Minuten bilden, zeitgleich mit Rac1-Aktivierung. Einmal in Gang gesetzt, wird die Adhäsionen weiterhin in die große Adhäsionsplaques in den 3 und 4 gezeigt reifen. Abbildung 1. Die Ultraschallwelle Form. Ultraschall umfasst eine intermittierende 1,5 MHz-Signal, dass aufgrund einer geringen Amplitude (30 mW / cm <sup> 2, hat räumliche Mittelwert, zeitlichen Durchschnitt) keine Heizung Wirkung. Abbildung 2. Schematische Darstellung der Workflow für die Vorbereitung und Stimulation der Zellen mit Ultraschall. Abbildung 3. Ultraschall Induktion der fokalen Adhäsionen in Fibroblasten. Fibroblasten wurden auf der Integrin-bindendes Fragment von Fibronectin (A) vor der Stimulation mit dem Syndecan-4-bindendes Fragment von Fibronectin (B) oder Ultraschall (C) verteilt sind. Nach 60 Minuten Stimulierung wurden die Zellen fixiert, gefärbt und Vinculin Actin und abgebildet durch Epifluoreszenz. Bar = 10 um. Abbildung 4. Ultraschall Induktion der fokalen Adhäsionen in Fibroblasten fehlen Syndecan-4. <em> SDC4 – / – Fibroblasten wurden auf der Integrin-bindendes Fragment von Fibronectin (A) vor der Stimulation mit dem Syndecan-4-bindendes Fragment von Fibronectin (B) oder Ultraschall (C) verteilt sind. Nach 60 Minuten Stimulierung wurden die Zellen fixiert, gefärbt und Vinculin Actin und abgebildet durch Epifluoreszenz. Obwohl SDC4 – / – Fibroblasten wurden Fibronektin-und Kleinschreibung, Ultraschall noch fokale Adhäsionen induziert, was darauf hinweist, dass Ultraschall umgeht Matrix-Rezeptor-Engagement. Bar = 10 um. Abbildung 5. Aktivierung von Rac1 durch Ultraschall. Die Zellen wurden 0, 10, 30 und 60 Minuten mit 6 Vertiefungen pro Zeitpunkt verwendet stimuliert. Die Menge an GTP-Rac1 in Proben von einem Rac1 Pull-down-Assay Zeitverlauf visualisiert wurde durch Inkubation mit Anti-Rac1 Antikörper auf einem Western-Blot (oberes Bild). Quantifizierung der Bandenintensität (durchschnittlich 8-10 Wiederholungen) zeigt eine erhöhte Rac1ctivity aus Ultraschall-Signal bei 10 und 30 Minuten, bevor sie wieder auf das Ausgangsniveau bei 60 Minuten (Grafik). Fehlerbalken stellen SEM