In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation
Summary
Questo studio descrive lo sviluppo di uno<em> In vitro</emElettroporazione> tecnica che permette la manipolazione di espressione genica nel labbro inferiore rombica di embrioni midgestation.
Abstract
Il labbro rombico è uno neuroepitelio embrionale situato nel rombencefalo alla giunzione tra il tubo neurale e la roofplate del quarto ventricolo (recensione in 1). Il labbro rombico può essere suddiviso nel labbro superiore romboidale (URL) che comprende rhombomere 1 (R1) e genera neuroni del cervelletto e il labbro inferiore romboidale (LRL) che dà luogo a diversi lignaggi tronco neuronali 2-4. LRL derivati comprendono i neuroni uditivi dei nuclei cocleari e quelle dei nuclei precerebellar che sono coinvolti nella regolazione dell'equilibrio e il controllo motorio 5-8. Neurogenesi dalla LRL si verifica su una grande finestra temporale che abbraccia giorni embrionali (E) 9,5-16,5 5, 9. Differenti linee neuronali emergono dal LRL come cellule postmitotico (o sono nati) durante il giorno di sviluppo distinti durante questa finestra neurogena.
Elettroporazione di costrutti di espressione genica può essere utilizzato permanipolare l'espressione genica in progenitori LRL e potenzialmente in grado di cambiare il destino dei neuroni ottenuti da questa regione 10-12. Alterare l'espressione genica dei progenitori LRL nel topo mediante elettroporazione in utero ha avuto molto successo per la manipolazione di lignaggi nati il giorno embrionale E12.5 o poi 10, 12-14. In elettroporazioni utero prima E12.5 non hanno avuto successo dovuto principalmente al mortalità associato con la puntura del roofplate quarto ventricolo, un passo necessario nella realizzazione di DNA esogeno che viene elettroporate nel LRL. Tuttavia, molti lignaggi LRL derivati nascono dalla LRL prima di E12.5 9. Questi lignaggi anteriore nati includono i neuroni che compongono il reticolare laterale, cuneate esterna e inferiore nuclei olivare del sistema precerebellar che funzionano per collegare gli ingressi dal midollo spinale e corteccia al cervelletto 5. Per manipolare espressione nel LRLdi embrioni con meno di E12.5, abbiamo sviluppato un sistema in vitro in cui si trovano gli embrioni nella cultura dopo l'elettroporazione.
Questo studio presenta un metodo efficiente ed efficace per manipolare l'espressione genica di progenitori LRL a E11.5. Gli embrioni elettroporate con la proteina fluorescente verde (GFP) guidato dal promotore CAG ampiamente attiva riproducibile espresso GFP dopo 24 ore di coltura. Un aspetto critico di questo saggio è che l'espressione genica è alterata solo per l'espressione del gene esogeno e non a causa di effetti secondari che derivano dalla elettroporazione e tecniche di coltura. E 'stato stabilito che i pattern di espressione dei geni endogeni restano indisturbati negli embrioni elettroporate e colta. Questo test può essere utilizzato per modificare il destino delle cellule che emergono dalla LRL di embrioni di età inferiore ai E12.5 attraverso l'introduzione di plasmidi per la sovraespressione o abbattere (tramite RNAi) di diverse pro-fattori di trascrizione neurali.
Protocol
Discussion
La tecnica di elettroporazione in vitro presentato in questo studio è una nuova metodologia che può essere efficacemente utilizzata per manipolare l'espressione genica in embrioni di età inferiore ai 12 giorni di gestazione. Posizionamento degli embrioni in cultura permette l'espressione del gene introdotto e aggira la letalità osservata quando embrioni elettroporate possono rimanere in vivo. Questa tecnica permette la manipolazione di espressione genica in progenitori embrionali precedente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Jane Johnson per il Math1, Ngn1, e gli anticorpi Ptf1a e Connie Cepko per la pCAG :: GFP plasmide. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH 1R15HD059922 R15-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
Riferimenti
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscienze. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
